編譯：微科盟牛魔王，編輯：微科盟茗溪、江舜堯。

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為了研究HFD在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生中的作用，我們用HFD或CD喂養(yǎng)經(jīng)AOM處理的常規(guī)雄性C57BL/6小鼠，同時(shí)進(jìn)行或不進(jìn)行定期抗生素雞尾酒治療 (圖1A)。在取樣前進(jìn)行小鼠結(jié)腸鏡檢查，飼喂HFD的小鼠出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤，但飼喂CD或用抗生素治療的HFD喂養(yǎng)的小鼠沒有觀察到明顯的腫瘤 (圖1B)。取樣時(shí)，飼喂HFD的小鼠的體重和脂肪量均高于飼喂CD的小鼠 (P<0.0001)，然而服用抗生素引起腸道微生物群減少的HFD喂養(yǎng)的小鼠，其體重和脂肪量沒有影響 (圖1C)。飼喂HFD的小鼠的結(jié)直腸癌數(shù)量和體積也明顯大于飼喂CD的小鼠 (均為P<0.05；圖1D) 。結(jié)腸切片的組織學(xué)檢查 (圖1E) 證實(shí)，與飼喂CD的小鼠相比，飼喂HFD的小鼠發(fā)生腺癌、高度和低度異長增生的比例更高 (P<0.05；圖1E)。飼喂HFD的小鼠結(jié)腸切片顯示Ki-67陽性細(xì)胞明顯增多，表明HFD喂養(yǎng)的小鼠細(xì)胞增殖增加 (P<0.01；圖1F)。然而，飼喂HFD的小鼠腸道微生物群被抗生素消耗后，結(jié)腸癌的數(shù)量和體積都顯著減少 (均為P<0.01；圖1D)，但飼喂CD的小鼠沒有顯著減少 (附圖1)。結(jié)腸切片的組織學(xué)檢查 (圖1E) 證實(shí)，服用抗生素的HFD組小鼠的腺癌、高度和低度異常增生的比例低于未服用抗生素的HFD組 (P<0.01；圖1E)，同時(shí)Ki-67陽性細(xì)胞顯著減少 (P<0.05；圖1F)。

為了驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，我們設(shè)置了轉(zhuǎn)基因Apc^min/+小鼠模型（圖2A）。與AOM誘導(dǎo)的結(jié)直腸腫瘤小鼠模型中的結(jié)果一致，HFD顯著增加Apc^min/+小鼠的體重和脂肪量（均為P<0.05），并且抗生素治療后HFD喂養(yǎng)對小鼠的體重和脂肪量沒有影響（圖2B）。HFD喂養(yǎng)的Apc^min/+小鼠結(jié)直腸腫瘤數(shù)目顯著高于CD喂養(yǎng)的Apc^min/+小鼠（P＜0.05；圖2C），也表現(xiàn)出腫瘤體積增大的趨勢（P＝0.07；圖2C）。此外，服用抗生素減少腸道微生物群顯著降低了HFD喂養(yǎng)的Apc^min/+小鼠的腫瘤數(shù)量（P<0.01）和體積（P<0.01；圖2C），但在CD喂養(yǎng)的Apc^min/+小鼠中沒有（補(bǔ)充圖2A和2B）。此外，在HFD喂養(yǎng)的Apc^min/+小鼠的小腸中也觀察到腫瘤體積增大，而抗生素誘導(dǎo)腸道微生物群減少顯著降低腫瘤體積（補(bǔ)充圖2C）。結(jié)腸切片的組織學(xué)檢查（圖2D）證實(shí)，與CD喂養(yǎng)的小鼠相比，HFD喂養(yǎng)的小鼠發(fā)生更大比例的腺癌和高度異常增生（P＜0.01；圖2D）。HFD喂養(yǎng)的Apc^min/+小鼠與CD喂養(yǎng)的Apc^min/+小鼠相比，Ki-67陽性細(xì)胞明顯增多（P＜0.05；圖2E）。而抗生素治療的HFD喂養(yǎng)的Apc^min/+小鼠顯示腺癌、高度和低度異常增生的比例降低（P＜0.01；圖2D）與無抗生素處理的HFD喂養(yǎng)小鼠相比，病理性Ki-67陽性細(xì)胞顯著減少（P＜0.05；圖2E）。這些發(fā)現(xiàn)一致表明HFD促進(jìn)結(jié)腸直腸腫瘤發(fā)生，并且腸道微生物群可能在介導(dǎo)HFD相關(guān)的CRC發(fā)展中起重要作用。

圖 2. 在 Apc^min/+小鼠模型中，HFD 依賴于腸道微生物群促進(jìn) CRC 發(fā)展。(A) Apc^min/+小鼠模型飲食和抗生素治療的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。(B) 第20周結(jié)腸鏡檢查的典型圖像。(C）CD喂養(yǎng)、HFD喂養(yǎng)和Abx處理的HFD喂養(yǎng)的Apc^min/+小鼠在處死前的體重和脂肪量。(D) CD喂養(yǎng)、HFD喂養(yǎng)和Abx處理的HFD喂養(yǎng)小鼠處死前的結(jié)直腸腫瘤數(shù)量和腫瘤體積的代表性圖像。(E) HE染色對小鼠結(jié)直腸的病理診斷。病理評分按以下標(biāo)準(zhǔn)定量分析: 正常0分; 1為LGD; 2為HGD; 3為癌癥。(F) 小鼠結(jié)直腸免疫組化染色，定量分析Ki-67指數(shù)。AOM，偶氮甲烷; CRC，結(jié)直腸癌；CD，控制飲食；HFD，高脂肪飲食；Abx，抗生素；HE，蘇木精和伊紅; LGD, 低度發(fā)育不良; HGD，高度發(fā)育不良; IHC,免疫化學(xué)。

為了探索腸道微生物失調(diào)在HFD相關(guān)CRC發(fā)展中的潛在作用，我們在AOM模型中對來自CD喂養(yǎng)，HFD喂養(yǎng)和抗生素治療的HFD喂養(yǎng)小鼠的糞便樣品進(jìn)行了鳥槍宏基因組測序。通過主成分分析（PCA）對CD喂養(yǎng)，HFD喂養(yǎng)和抗生素治療的HFD喂養(yǎng)的小鼠的微生物群組成進(jìn)行鑒定（圖3A）。與CD喂養(yǎng)的小鼠相比，HFD喂養(yǎng)的小鼠中細(xì)菌多樣性降低以及細(xì)菌豐富度降低（圖3A）。在HFD喂養(yǎng)的小鼠中有幾種細(xì)菌類群存在差異（圖3B）。HFD喂養(yǎng)的小鼠中潛在致病細(xì)菌種類（包括Alistipes sp. Marseille-P5997和Alistipes sp. 5CPEGH6）的豐度顯著高于CD喂養(yǎng)的小鼠（均為P<0.01；圖3C）；同時(shí)，兩種保護(hù)性細(xì)菌，Parabacteroides distasonis（狄氏副擬桿菌，P. distasonis）和Parabacteroides sp. CT06在HFD喂養(yǎng)的小鼠中顯著減少（均為P<0.01；圖3C）。通過定量PCR驗(yàn)證了與CD喂養(yǎng)的Apc^min/+小鼠相比，在HFD喂養(yǎng)的Apc^min/+小鼠中Alistipes sp. Marseille-P5997和P. distasonis的差異豐度發(fā)生典型失調(diào)（補(bǔ)充圖3）。另外的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明P. distasonis抑制細(xì)胞生長，Alistipes sp.促進(jìn)CRC細(xì)胞系（Caco-2和HCT116）的細(xì)胞生長（圖3D），表明HFD誘導(dǎo)的腸道微生物組成的變化可能至少部分有助于CRC的發(fā)展。

為了驗(yàn)證腸屏障功能是否在HFD相關(guān)的結(jié)直腸腫瘤發(fā)生中起作用，我們通過測定血清LPS水平來檢測HFD對小鼠結(jié)腸細(xì)胞旁通透性的影響。與用AOM處理的CD喂養(yǎng)的小鼠相比， HFD喂養(yǎng)的小鼠血清LPS濃度升高 (P<0.05；圖3E)。與此一致，透射電鏡下的腸道屏障結(jié)構(gòu)證實(shí)了HFD喂養(yǎng)的小鼠結(jié)腸細(xì)胞間連接的異常，包括頂端連接復(fù)合體和細(xì)胞旁間隙的間隙擴(kuò)大，表明屏障功能受損 (圖3F)。此外，HFD喂養(yǎng)的小鼠緊密連接蛋白E-cadherin (一種細(xì)胞粘附分子) 和Claudin-3 (緊密連接的關(guān)鍵成分，作為腸道屏障完整性的標(biāo)志) 的表達(dá)顯著減少 (均為P<0.01；圖3G)。E-cadherin和Claudin-3蛋白的分布主要定位于CD喂養(yǎng)小鼠的結(jié)腸上皮細(xì)胞膜上，但在HFD喂養(yǎng)的小鼠中它們的表達(dá)被分解 (均為P<0.01；圖3H)。而服用抗生素的HFD小鼠，其腸道屏障結(jié)構(gòu)得到改善 (圖3F)，E-cadherin和Claudin-3的蛋白表達(dá)恢復(fù) (E-cadherin, P<0.01；Claudin-3，P<0.05) (圖3G)，E-cadherin和Claudin-3的分布和密度增加 (E-cadherin, P<0.01；Claudin-3，P<0.05) (圖3H)。綜上所述，這些結(jié)果表明HFD至少部分是通過引起腸道微生物失調(diào)而導(dǎo)致結(jié)腸屏障功能受損的。

圖 3. HFD 誘導(dǎo)腸道微生物群失調(diào)和腸道屏障功能障礙。(A) AOM 治療的 CD 喂養(yǎng)、HFD 喂養(yǎng)和 Abx 治療的 HFD 喂養(yǎng)的小鼠的無監(jiān)督主成分分析、Shannon多樣性和腸道微生物群的物種豐富度。(B) CD 喂養(yǎng)、HFD 喂養(yǎng)和 Abx 處理的 HFD 喂養(yǎng)小鼠腸道微生物組的熱圖。(C) 與用 AOM 治療的 CD 喂養(yǎng)或 Abx 治療的 HFD 喂養(yǎng)小鼠相比，HFD 喂養(yǎng)小鼠中的Alistipes sp. Marseille-P5997，Alistipes sp. 5CPEGH6，P. distasonis 和 Parabacteroides sp. CT06的豐度。(D) Caco-2 和 HCT116 CRC 細(xì)胞與 P. distasonis、Alistipes sp、大腸桿菌和空白對照共培養(yǎng)的生長曲線。(E) AOM 模型中 CD 喂養(yǎng)和 HFD 喂養(yǎng)小鼠血清中的 LPS 濃度。(F) 通過 TEM 顯示 CD 喂養(yǎng)、HFD 喂養(yǎng)和 Abx 處理的 HFD 喂養(yǎng)小鼠的細(xì)胞間連接的代表性圖像。(G) 通過蛋白質(zhì)印跡和定量分析，腸道屏障相關(guān)蛋白 E-cadherin 和 Claudin-3 在 CD 喂養(yǎng)、HFD 喂養(yǎng)和 Abx 處理的 HFD 喂養(yǎng)小鼠的結(jié)直腸組織中的表達(dá)水平。(H) 免疫組化定量分析CD喂養(yǎng)、HFD喂養(yǎng)和Abx喂食HFD喂養(yǎng)小鼠結(jié)直腸組織中粘附分子 E-cadherin 和 Claudin-3的分布 *P < 0.05，**P < 0.01， *** P < 0.001。CD，控制飲食；HFD，高脂肪飲食；Abx，抗生素；TEM，透射電子顯微鏡；IHC，免疫化學(xué)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證HFD調(diào)節(jié)的微生物群對結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的影響，我們將HFD喂養(yǎng)的小鼠的糞便樣本轉(zhuǎn)移到用AOM處理的無菌小鼠 (圖4A)。糞便微生物群移植沒有改變AOM處理的無菌小鼠的體重和脂肪量 (補(bǔ)充圖4A)。用HFD喂養(yǎng)的小鼠的糞便樣品灌胃的無菌小鼠與灌胃PBS的AOM處理的無菌小鼠相比 (圖4B)， 另枝菌屬顯著富集 (P<0.001，補(bǔ)充圖4B)，結(jié)直腸腫瘤的數(shù)量增多 (P<0.01) 以及腫瘤的體積增大 (P<0.05)。結(jié)直腸腫瘤經(jīng)組織學(xué)證實(shí)為低度異常增生 (圖4C)。與此相一致的是，AOM處理的HFD喂養(yǎng)的小鼠（HFD-FMT-AOM）結(jié)腸組織中Ki-67陽性細(xì)胞較對照組AOM處理的小鼠明顯增多 (P<0.05；圖4D)。此外，與對照組小鼠相比，灌胃HFD小鼠糞便標(biāo)本的小鼠結(jié)直腸組織中E-cadherin和Claudin-3的表達(dá)明顯減少 (E-cadherin和Claudin-3分別為P<0.05和P<0.01；圖4E)。同樣，E-cadherin和Claudin-3蛋白在HFD-FMT-AOM小鼠中被分解，但在對照AOM小鼠的結(jié)腸上皮細(xì)胞膜上易表達(dá) (E-cadherin和Claudin-3分別為P<0.01和P<0.05；圖4F)。綜上所述，這些結(jié)果表明，HFD調(diào)節(jié)的腸道微生物群通過損害腸道屏障功能促進(jìn)了結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。

為了揭示由HFD誘發(fā)的代謝變化，我們對用AOM處理的CD喂養(yǎng)的小鼠，HFD喂養(yǎng)的小鼠和抗生素治療的HFD喂養(yǎng)的小鼠的糞便樣品進(jìn)行代謝譜分析。根據(jù)無監(jiān)督PCA分析和PLS判別監(jiān)督分析（PLS-DA），發(fā)現(xiàn)膳食脂肪攝入和抗生素治療的腸道代謝物顯著不同（圖5A）。與CD喂養(yǎng)的小鼠相比，在HFD喂養(yǎng)的小鼠中鑒定出差異的代謝物（圖5B，補(bǔ)充表4）。其中，包括溶血磷脂酰膽堿（LPC）和溶血磷脂酸（LPA）（LPC的下游代謝物）在內(nèi)的甘油磷脂都是HFD喂養(yǎng)小鼠中上調(diào)最多的異常代謝物（圖5B，補(bǔ)充圖5）。與CD喂養(yǎng)的小鼠相比，HFD喂養(yǎng)的小鼠中上調(diào)的代謝物富含不同的代謝組學(xué)信號傳導(dǎo)途徑。在這些途徑中，甘油磷脂代謝是喂養(yǎng)HFD的小鼠中改變的主要途徑（圖5C）。另一方面，與HFD喂養(yǎng)的小鼠相比，抗生素治療的HFD喂養(yǎng)小鼠中腸道微生物群的減少顯著恢復(fù)了已改變的代謝物（圖5D，補(bǔ)充表5），LPA和LPC水平降低（圖5D，補(bǔ)充圖5）。同樣地，腸道微生物群的消耗減少了包括甘油磷脂代謝在內(nèi)的途徑（圖5E）。

我們通過綜合分析確定了HFD喂養(yǎng)的小鼠腸道微生物變化和代謝產(chǎn)物之間的潛在聯(lián)系。發(fā)現(xiàn)Alistipes  sp. Marseille-P5997, Alistipes sp. 5CPEGH6, Bifidobacterium animalis（動物雙岐桿菌） 以及 Alistipes shahii的富集與LPA、LPC均呈正相關(guān) (圖5F)。而Parabacteroides sp. CT06 和P. distasonis與LPA和LPC均呈負(fù)相關(guān) (圖5F)。這些結(jié)果表明，腸道微生物群及其相關(guān)的代謝物的改變都有助于HFD相關(guān)的結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。

用差異和非差異代謝物處理兩種CRC細(xì)胞系（Caco-2和HCT116）和一種正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞系（NCM460）去探索HFD改變的代謝物在CRC發(fā)展中的潛在作用。與CD喂養(yǎng)的小鼠相比，HFD喂養(yǎng)的小鼠中的去甲二氫愈創(chuàng)木酸（NDGA）和神經(jīng)酸顯著減少（補(bǔ)充圖6A）。肌苷是HFD喂養(yǎng)的小鼠和CD喂養(yǎng)的小鼠之間的非差異代謝物之一，用作陰性對照。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，NDGA通過抑制細(xì)胞生長，顯著抑制CRC細(xì)胞系Caco-2和HCT116的細(xì)胞增殖，但不抑制正常上皮細(xì)胞系NCM460的細(xì)胞增殖（均為P＜0.01；圖6A）和集落形成（均為P＜0.01；圖6B）。同樣，神經(jīng)酸也抑制Caco-2和HCT116細(xì)胞生長（均為P＜0.01；補(bǔ)充圖6B）和集落形成（均為P＜0.05）（補(bǔ)充圖6C）。此外，我們分別用NDGA和神經(jīng)酸處理患者來源的CRC類器官，發(fā)現(xiàn)NDGA和神經(jīng)酸均可顯著抑制CRC類器官生長（均為P<0.01，補(bǔ)充圖6D）。然后，我們關(guān)注HFD喂養(yǎng)后富集的代謝物L(fēng)PA的致癌作用。我們發(fā)現(xiàn)LPA能顯著促進(jìn)三種結(jié)直腸細(xì)胞系的增殖（均為P＜0.01；圖6C）。細(xì)胞周期分析顯示，與空白對照相比，LPA處理加速了HCT116中從G1期到S期的細(xì)胞周期進(jìn)程，以及Caco-2細(xì)胞中從G1期到S期和G2期的細(xì)胞周期進(jìn)程（圖6D）。同樣，經(jīng)LPA處理后的CRC細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA），細(xì)胞周期蛋白D1和已下調(diào)的P27蛋白表達(dá)上調(diào)（圖6E）。另外，我們使用或不使用LPA處理患者來源的CRC類器官以進(jìn)一步證實(shí)LPA的致癌作用，并證明LPA顯著促進(jìn)CRC類器官的生長和增殖（圖6F）。此外，我們還檢查了LPA是否會影響上皮屏障功能。與其空白對照相比，在LPA處理的HCT116，Caco-2和NCM460細(xì)胞中觀察到上皮細(xì)胞鈣粘蛋白和閉合蛋白表達(dá)顯著降低，推斷LPA可能損害屏障功能（圖6G）。總之，這些結(jié)果表明HFD至少部分通過提高致癌代謝物L(fēng)PA和減少潛在的有益代謝物NDGA和神經(jīng)酸來促進(jìn)CRC發(fā)展。

  
 圖
 6. HFD改變的代謝物有助于細(xì)胞增殖和細(xì)胞連接損傷。
 （A）用NDGA和肌苷（作為陰性對照）處理的CRC細(xì)胞系Caco-2，HCT116和正常結(jié)腸細(xì)胞系NCM460的細(xì)胞生長曲線。
 （B）用NDGA和肌苷（作為陰性對照）處理的CRC細(xì)胞系中集落形成的代表性圖像和定量分析。
 （C）用LPA和肌苷（作為陰性對照）處理的CRC細(xì)胞系Caco-2，HCT116和正常結(jié)腸細(xì)胞系NCM460的細(xì)胞生長曲線。
 （D）用或不用LPA處理的HCT 116細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞用碘化丙啶（PI）染色并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。
 （E）用LPA和肌苷處理的HCT 116和Caco-2細(xì)胞中細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白PCNA，細(xì)胞周期蛋白D1和P27的表達(dá)水平。
 （F）用LPA和肌苷處理的CRC類器官的代表性圖像和類器官活力測定。
 （G）腸屏障功能相關(guān)蛋白E-cadherin和Occludin在HCT116，Caco-2和NCM460細(xì)胞系中的表達(dá)水平。
 LPA，溶血磷脂酸；
 PCNA，增殖細(xì)胞核抗原；
 CRC，結(jié)直腸癌。

為了評估HFD調(diào)節(jié)的腸道微生物群和代謝產(chǎn)物對腸道細(xì)胞增殖和致瘤性轉(zhuǎn)化的直接影響，用HFD喂養(yǎng)的小鼠 (HFD-FMT) 和CD喂養(yǎng)的小鼠 (CD-FMT) 的糞便灌胃無菌小鼠。所有這些無菌小鼠都喂以正常的食物，在實(shí)驗(yàn)過程中沒有任何干擾(圖7A)。與CD-FMT小鼠相比，HFD-FMT小鼠的體重和脂肪量沒有差異 (補(bǔ)充圖7)。與CD-FMT小鼠相比，HFD-FMT小鼠糞便可促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞顯著增殖，Ki-67陽性細(xì)胞增多 (P<0.01；圖7B)，PCNA蛋白表達(dá)增多 (P<0.05；圖7C)。為了從機(jī)制上了解HFD調(diào)控的腸道微生物群/代謝物如何促進(jìn)結(jié)直腸增殖，利用Mouse Cancer Pathway Finder PCR Array檢測了HFD-FMT小鼠結(jié)直腸組織的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)HFD-FMT小鼠與CD-FMT小鼠相比，癌基因上調(diào)和抑癌基因下調(diào)，這些基因主要參與調(diào)控細(xì)胞增殖 (CCND2，McM2，Mki67)、上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 (GSC)、缺氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo) (EPO) 的表達(dá)（圖7D）。

我們證實(shí)了與CD-FMT小鼠相比，HFD-FMT小鼠的血清LPS水平顯著升高(P<0.05)，E-cadherin和Claudin-3的結(jié)直腸蛋白顯著降低 (均為P<0.01；圖7E)， HFD相關(guān)腸道微生物群在HFD相關(guān)性結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起到了腸道屏障功能障礙的作用。相應(yīng)地，HFD-FMT小鼠與CD-FMT小鼠相比，E-cadherin和Claudin-3的蛋白表達(dá)和密度均顯著降低 (均為P<0.01；圖7F)。我們評估了受體無菌小鼠腸道微生物群的組成，發(fā)現(xiàn)HFD-FMT小鼠與CD-FMT小鼠腸道微生物群顯著不同 (圖7G)，包括潛在致病菌Alistipes sp. 5CPEGH6 和 Alistipes sp. Marseille P5997的富集 (均為P<0.05；圖7H)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明HFD相關(guān)的腸道微生物群/代謝物直接促進(jìn)結(jié)直腸細(xì)胞增殖并損害腸道屏障功能。

在本研究中，我們證明了高脂肪含量的飲食促進(jìn)了不同小鼠模型的結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。有研究表明西方飲食與人類結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)，這證明了HFD在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生中的促腫瘤作用。食用高脂飲食通常會導(dǎo)致肥胖，這會使男性患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加30%-70%。多項(xiàng)證據(jù)表明，肥胖相關(guān)的脂肪細(xì)胞因子、膽汁酸失衡和腸道微生物群失調(diào)均有助于結(jié)直腸癌的發(fā)生。雖然在AOM處理模型和Apc^min/+模型中，HFD喂養(yǎng)的小鼠的體重、脂肪量和腫瘤負(fù)荷都有所增加，但抗生素減少腸道微生物群降低了腫瘤負(fù)荷，但不改變體重或脂肪量。無菌模型進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，在無菌模型中，轉(zhuǎn)移了HFD相關(guān)腸道微生物群的小鼠存在更大的腫瘤負(fù)擔(dān)以及細(xì)胞增殖加快，但沒有顯著的體重變化。這些發(fā)現(xiàn)共同表明HFD/肥胖相關(guān)的腸道微生物群在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生中起著重要作用。

接下來，我們發(fā)現(xiàn)HFD喂養(yǎng)的小鼠表現(xiàn)出不同的微生物群組成，因此暗示了腸道微生物群失調(diào)的發(fā)生。Alistipes sp. Marseille-P5997 和 Alistipes sp. 5CPEGH6在HFD喂養(yǎng)的小鼠中顯著富集。特別是，在食用HFD的人類中也發(fā)現(xiàn)Alistipes屬的富集。Alistipes與結(jié)直腸腫瘤負(fù)擔(dān)呈正相關(guān)。此外，將我們的小鼠模型的微生物群結(jié)果與結(jié)直腸癌患者和對照組的結(jié)果相比較，發(fā)現(xiàn)Alistipes在小鼠模型和人類結(jié)直腸癌患者中均有富集，這表明HFD誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌小鼠模型腸道微生物群改變與結(jié)直腸癌患者的特征有一定的相似之處。同樣，我們的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，Alistipe sp.可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長 (圖3D)。此外，據(jù)報(bào)道Alistipes finegoldii能夠通過IL-6/STAT3途徑促進(jìn)了CRC的形成。綜上所述，Alistipes在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生中作為潛在的病原體。另一方面，兩種益生菌P. disasonis和Parabacteroides sp. CT06在HFD喂養(yǎng)的小鼠體內(nèi)減少。本研究證實(shí)了P. disasonis的保護(hù)作用，它能抑制體外培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長。此外，已有的研究證實(shí)P. disasonis通過阻斷Toll樣受體4信號通路和Akt激活來減少體內(nèi)結(jié)腸腫瘤的形成。此外，P. disasonis還參與維持腸上皮屏障功能，以抑制結(jié)直腸癌的發(fā)展。我們進(jìn)一步證實(shí)，HFD調(diào)節(jié)的腸道微生物群可以促進(jìn)AOM處理的無菌小鼠的結(jié)直腸癌的發(fā)生，這表明用HFD喂養(yǎng)的小鼠的糞便樣本灌胃的無菌小鼠結(jié)腸癌的形成明顯增加，并伴隨著腸道屏障功能的受損。這些結(jié)果證實(shí)HFD所致腸道微生物失調(diào)，致癌病原菌富集，保護(hù)菌減少，在HFD相關(guān)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

然后，我們探討了由HFD誘發(fā)改變的上皮屏障功能及其相關(guān)的腸道微生物群變化。在HFD喂養(yǎng)的小鼠中觀察到血清LPS水平升高。此外，在HFD喂養(yǎng)的小鼠的結(jié)直腸中頂端連接復(fù)合物和細(xì)胞間隙的空間變大以及腸屏障相關(guān)標(biāo)志蛋白質(zhì): E-cadherin和Claudin-3的表達(dá)降低，表明腸屏障功能受損。然而，我們發(fā)現(xiàn)向HFD喂養(yǎng)的小鼠服用抗生素以減少腸道微生物群，恢復(fù)了受損的腸道屏障功能，推斷腸道微生物生態(tài)失調(diào)參與了HFD相關(guān)的腸道屏障功能障礙。一些飲食方案可以推動微生物組的轉(zhuǎn)變，而這反過來又會以各種方式導(dǎo)致屏障的破壞。粘膜屏障的破壞可能導(dǎo)致共生微生物（包括病原體）無限制的通過固有層甚至血液，使其更容易影響CRC的發(fā)展。此外，在結(jié)直腸粘膜的組織病理學(xué)變化之前或之后觀察到CRC患者中LPS水平增加和動物模型中結(jié)直腸通透性增加，表明腸道屏障受損有助于CRC發(fā)展�？偠�言之，這些結(jié)果表明HFD誘發(fā)的結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生與腸道屏障功能受損有關(guān)，其機(jī)制可能與腸道生物失調(diào)有關(guān)。

隨后，我們評估了HFD相關(guān)的腸道微生物失調(diào)在HFD相關(guān)的結(jié)直腸腫瘤發(fā)生中的作用。在兩種常規(guī)模型中，服用抗生素減少腸道微生物群，顯著降低了HFD相關(guān)腫瘤的發(fā)生，表明HFD相關(guān)的小鼠結(jié)直腸腫瘤發(fā)生與完整微生物群的存在有關(guān)。利用無菌動物模型，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了HFD調(diào)控的腸道微生物群可以直接促進(jìn)AOM處理的無菌小鼠結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。我們的結(jié)果進(jìn)一步得到了兩種腸道腫瘤小鼠模型K-ras^G12Dint小鼠和Apc^min/+小鼠的研究結(jié)果的支持，這兩種小鼠模型在遺傳上易患腸道腫瘤。與沒有糞便微生物組移植的K-ras^G12Dint小鼠相比，將HFD喂養(yǎng)的腸道腫瘤小鼠的糞便樣本轉(zhuǎn)移到經(jīng)過充分抗生素治療的健康成年K-ras^G12Dint小鼠，可以誘導(dǎo)小腸腫瘤的發(fā)展和病理評分的增加。在接受相同糞便微生物群轉(zhuǎn)移的Apc^min/+小鼠中也發(fā)現(xiàn)了類似的情況。此外，抗生素治療完全阻斷了HFD誘導(dǎo)的K-ras^G12Dint小鼠的腫瘤進(jìn)展，這與我們在AOM處理的Apc^min/+小鼠中的結(jié)果一致，表明微生物群的明顯變化在加劇腸道癌變中起著關(guān)鍵作用。綜上所述，我們的發(fā)現(xiàn)表明腸道微生物群在調(diào)節(jié)HFD相關(guān)的結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生中是必不可少的。

除了腸道菌群失調(diào)之外，由膳食食物和共生細(xì)菌產(chǎn)生的小分子代謝物也可能有助于CRC的發(fā)展。腸道微生物相關(guān)代謝物可以激活和拮抗其同源受體，以減少或加劇腸道腫瘤的發(fā)展。因此，我們揭示了腸道代謝物改變對HFD相關(guān)結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的作用。與CD喂養(yǎng)的小鼠相比，HFD喂養(yǎng)的小鼠的代謝組學(xué)特征發(fā)生了明顯的變化。NDGA是一種經(jīng)典的酚木脂素，在HFD喂養(yǎng)的小鼠中減少。我們證明NDGA可以顯著抑制CRC細(xì)胞生長和集落形成。動物研究進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)，有研究報(bào)道NDGA可預(yù)防肺癌發(fā)生并抑制異種移植模型中非小細(xì)胞肺癌的生長，這表明NDGA可能是癌癥治療中潛在的治療補(bǔ)充劑。除NDGA外，還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酸在HFD喂養(yǎng)的小鼠中減少。我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酸抑制CRC細(xì)胞增殖和集落形成。據(jù)報(bào)道，在肥胖小鼠模型中神經(jīng)酸減少，補(bǔ)充神經(jīng)酸可以減輕HFD喂養(yǎng)的小鼠的體重和脂肪量，并改善代謝參數(shù)，這表明神經(jīng)酸是預(yù)防肥胖和CRC的潛在補(bǔ)充劑。

更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)在具有完整腸道微生物群的HFD喂養(yǎng)的小鼠中LPA和LPC水平升高，但在腸道微生物組減少的小鼠中沒有，并促進(jìn)小鼠CRC發(fā)展。此外，證明了LPA的促腫瘤發(fā)生功能，其中LPA促進(jìn)CRC細(xì)胞系和患者衍生的CRC類器官中的細(xì)胞增殖并加速細(xì)胞周期。升高的LPA還損害CRC細(xì)胞系中的上皮細(xì)胞連接。LPA和LPC都可能是磷脂酶A2組1B（PLA2g1b）被腸道微生物群操縱產(chǎn)生的生物活性脂肪分解產(chǎn)物。LPA的致癌特性已在不同的癌癥中得到證實(shí)。最近的研究表明，autotaxin-LPA軸促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞增殖，阻斷autotaxin-LPA軸可以抑制體內(nèi)胰腺癌生長，表明LPA可能是癌癥治療的藥物靶標(biāo)�？偠�言之，我們的研究結(jié)果表明，HFD及其相關(guān)的腸道微生物群失調(diào)，導(dǎo)致致癌LPA水平升高，促進(jìn)細(xì)胞增殖并損害腸道屏障，從而促進(jìn)CRC的發(fā)展。

最后，我們探討了HFD調(diào)節(jié)的腸道微生物群/代謝產(chǎn)物在正常飲食條件下對無菌小鼠健康結(jié)腸粘膜的直接影響。在正常飲食條件下，接受HFD小鼠糞便的無菌小鼠細(xì)胞顯著增殖，表明HFD調(diào)節(jié)的腸道微生物群/代謝產(chǎn)物在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面起著直接作用。從機(jī)制上，我們揭示了HFD調(diào)控的腸道微生物群/代謝物可以上調(diào)癌基因的表達(dá)，這些基因主要參與調(diào)控細(xì)胞增殖和上皮向間質(zhì)的轉(zhuǎn)變。腸道微生物群具有調(diào)節(jié)遺傳或表觀遺傳表達(dá)的能力。以往的研究表明，腸道微生物群可通過WNT信號通路的過度激活影響突變型p53促進(jìn)腸道腫瘤形成。此外，將結(jié)直腸癌患者的糞便移植到無菌小鼠身上，與細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因發(fā)生上調(diào)，這支持了我們在這項(xiàng)研究中的結(jié)論。此外，與CD-FMT無菌小鼠相比，HFD-FMT無菌小鼠的腸道屏障相關(guān)蛋白表達(dá)減少，表明HFD調(diào)節(jié)的腸道微生物群在結(jié)直腸癌發(fā)病前的腸道屏障功能受阻中起直接作用。這與結(jié)腸通透性增高可能早于結(jié)腸粘膜的組織病理學(xué)改變的報(bào)道一致。HFD-FMT小鼠和CD-FMT小鼠在腸道菌群組成上存在顯著差異，提示腸道菌群失調(diào)可能是導(dǎo)致腸道屏障功能障礙的觸發(fā)因素之一。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，攝入過量脂肪引起腸道微生物群/代謝產(chǎn)物的改變，加速了細(xì)胞增殖和腸道屏障功能障礙，導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)，HFD通過誘導(dǎo)小鼠腸道微生物失調(diào)、代謝改變和腸道上皮屏障功能受損來推動結(jié)直腸癌的發(fā)生 (補(bǔ)充圖8)。HFD調(diào)控的腸道微生物群可能通過上調(diào)癌基因表達(dá)，損害腸道屏障功能，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。調(diào)節(jié)腸道微生物群和代謝產(chǎn)物可能是預(yù)防和治療HFD相關(guān)結(jié)直腸癌的潛在治療策略。