導(dǎo)讀  

放療不可避免地與各種影響癌癥患者生活質(zhì)量的副作用交織在一起。本研究報道了口腔微生物群的改變可能會影響原發(fā)性直腸癌和結(jié)直腸癌(CRC)肝轉(zhuǎn)移的治療療效和預(yù)后，這些轉(zhuǎn)移在病理上破壞了胃腸道的完整性和功能。16S rRNA測序顯示，在CRC小鼠模型中，口腔微生物群的改變會導(dǎo)致腫瘤內(nèi)的腸道細(xì)菌組成發(fā)生改變，但不會改變鄰近腫瘤周圍組織的細(xì)菌組成。特別是口腔具核梭桿菌 (Fusobacterium nucleatum) 向CRC位點(diǎn)遷移，影響放療的療效和預(yù)后。給藥一種特殊的抗生素甲硝唑，消除了口腔微生物組波動對CRC放療的不良影響�？谇痪�群也通過腸道微生物與輻射誘導(dǎo)的腸道損傷相關(guān)。我們的研究結(jié)果表明，口腔微生物組與其腸道微生物組的協(xié)同作用影響CRC放療的療效和預(yù)后。

論文ID

原名：Oral microbiota affects the efficacy and prognosis of radiotherapy for colorectal cancer in mouse models 

譯名：口腔微生物群影響結(jié)直腸癌小鼠模型的放療療效和預(yù)后

期刊：Cell Reports

IF：9.423

發(fā)表時間：2021.10.26

通訊作者：崔明＆樊賽軍

通訊作者單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所

DOI號：10.1016/j.celrep.2021.109886

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)果

1 口腔微生物群影響小鼠結(jié)直腸癌的發(fā)展

為了誘導(dǎo)自發(fā)性CRC，小鼠暴露于氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉(AOM/DSS;圖S1A)，然后在特制的籠子中飼養(yǎng)，以避免排泄物微生物組可能因糞養(yǎng)對口腔菌群的影響(圖S1B和S1C)。為了確定口腔微生物群是否影響CRC的進(jìn)程，根據(jù)疾病嚴(yán)重程度和病理表現(xiàn)(如體重減輕、直腸出血、糞便不一致)將小鼠分為兩組。與輕癥組相比，嚴(yán)重組小鼠結(jié)腸較短，腫瘤更多、更大(圖1A-1D)，組織損傷更嚴(yán)重(圖1E)。

然后我們比較了不同疾病嚴(yán)重程度(輕微和嚴(yán)重)的健康正常和患病動物的口腔細(xì)菌組成。與健康正常對照相比，輕度疾病動物口腔細(xì)菌多樣性增加，病情進(jìn)展較嚴(yán)重的動物口腔細(xì)菌多樣性進(jìn)一步增加(圖S1D-S1H)。β多樣性分析揭示了三個不同隊(duì)列之間口腔細(xì)菌類群組成的詳細(xì)差異(圖1F和1G)。此外，主坐標(biāo)分析(PCoA)顯示三組口腔菌群明顯分離(圖1H和S1I)。具體來說，與輕癥組小鼠相比，嚴(yán)重組小鼠口腔中擬桿菌屬（Bacteroides）、孿生球菌屬（Gemella）和鏈球菌屬（Streptococcus）在屬水平上相對豐度較低(圖1I-1L)，表明口腔微生物群模式可能與CRC的發(fā)生有關(guān)。

圖 1 在 AOM/DSS 誘導(dǎo)的小鼠模型中，口腔菌群分布與結(jié)直腸癌的嚴(yán)重程度相關(guān)。 (A 和 B) 輕微 或嚴(yán)重傷害動物小鼠結(jié)腸組織的代表性照片 (A) 和長度定量 (B) 。 顯著性差異： *p ＜ 0.05; 兩組間雙側(cè) Student’s t 檢驗(yàn)； 每組 n=8 。 (C 和 D) 縱向切開結(jié)腸以顯示結(jié)直腸內(nèi)腫瘤數(shù)量的宏觀視圖 (C) 和定量 (D) 。 顯著差異： *p ＜ 0.05 ； 兩組間雙側(cè) Student’s t 檢驗(yàn)； 每組 n=8 。 (E) 用 H&E 染色顯示輕度和重度小鼠結(jié)腸的形態(tài)； 比例尺， 75 μm 。 (F 和 G) 通過非加權(quán) / 加權(quán) Unifrac 分析比較口腔細(xì)菌 β 多樣性。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)； 每組 n=8 。 (H) 采用非加權(quán)主坐標(biāo)分析 (PCoA) 評估口腔細(xì)菌分類譜的變化。 顯著性差異： 分子方差分析 (AMOVA) ； 每組 n=8 。 (I) 使用 16S 高通量測序評估正常、輕微和嚴(yán)重?fù)p傷小鼠口腔細(xì)菌屬水平的變化。 熱圖是基于行 Z 得分的顏色。 細(xì)菌水平最低和最高的小鼠分別用藍(lán)色和紅色表示。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)； 每組 n=8 。 (J-L) 采用 16S 高通量測序法測定口腔樣本中 Bacteroides、Gemella 和 Streptococcus 的相對豐度。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)； 每組 n=8 。 參見圖 S1 和表 S2。

2 口腔微生物組成影響CRC和CRC肝轉(zhuǎn)移的放療療效和預(yù)后

在全腹照射(TAI)后，我們重復(fù)進(jìn)行口腔微生物群移植(OMT) 10天，以改變接受小鼠的口腔微生物群，并檢測OMT對CRC放療療效的影響(圖S1J和S1K)。盡管所有實(shí)驗(yàn)動物最初有相似的口腔微生物群(圖S2A-S2D)，與對照組相比，輻射暴露后第14天，CRC小鼠的α和β多樣性增加。然而，在TAI后，OMT顯著降低了CRC小鼠的α多樣性并提高了β多樣性(圖2A, 2B和S2E-S2I)。未加權(quán)PCoAs和加權(quán)PCoAs顯示，TAI促進(jìn)口腔微生物組成的顯著差異，而OMT促進(jìn)口腔微生物的分離(圖2C和S2J)，表明OMT重組了小鼠口腔微生物組成。例如，OMT降低了輻照后屬水平Bacteroides和Gemella的相對豐度，增加了Streptococcus的相對豐度(圖2d-2G)。

然而，OMT顯著縮短了結(jié)腸長度，表明口腔微生物組改變可能對輻射誘導(dǎo)的結(jié)腸炎有不利影響(圖2H和2I)。此外，OMT也阻礙了輻照的腫瘤殺傷作用。正如預(yù)期的那樣，根據(jù)腫瘤數(shù)量和大小的減少以及Ki-67(增殖標(biāo)記物)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)(血管生成標(biāo)記物)和C-X-C趨化因子配體1(CXCL1，一種免疫細(xì)胞介質(zhì))的相關(guān)蛋白水平來判斷，TAI顯著減少了AOM/DSS誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生(圖2J-2M)。ELISA檢測顯示，OMT提高了照射后結(jié)直腸中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生(圖2N和2O)。由于盆腔和腹腔放射治療經(jīng)常與不可避免的副作用相關(guān)，我們確定了OMT如何影響輻射誘導(dǎo)的胃腸道毒性。OMT顯著加重了輻射誘導(dǎo)的胃腸道毒性，這可以從短的小腸絨毛和稀疏的結(jié)腸結(jié)構(gòu)(圖S2K)，促炎細(xì)胞因子升高(圖2P和S2L-S2N)，以及小腸上皮完整性受損(圖2Q, S2O和S2P)來判斷。我們的研究結(jié)果表明，在CRC的臨床治療中，口腔微生物群的致病成員可能會損害放療的療效。

為了確定口腔菌群組成是否與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)，手術(shù)將HCT-8細(xì)胞注入裸鼠脾臟。如圖2R和2S所示，12 Gy TAI減少了肝轉(zhuǎn)移灶的腫瘤面積，經(jīng)OMT治療后，腫瘤面積反而恢復(fù)。免疫組化染色進(jìn)一步證實(shí)，OMT加重了放療后CRC肝轉(zhuǎn)移組織中Ki-67、VEGF和Bcl-2(一種抗凋亡標(biāo)志物)的蛋白水平(圖2T和2U)，支持口腔病原體對放療后CRC肝轉(zhuǎn)移的致病影響。

圖 2 OMT 影響 CRC 和 CRC 肝轉(zhuǎn)移放療的療效。 (A 和 B) 暴露 TAI 14 天后，采用 16S rRNA 高通量測序檢測口腔細(xì)菌的非加權(quán) (A) 和加權(quán) (B)Unifrac 分析。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)； 每組 n = 9 。 (C) 用 16S rRNA 高通量測序法檢測 12 Gy TAI 后 14 天小鼠口腔細(xì)菌的未加權(quán) PCoA 。 顯著差異： AMOVA ； 每組 n = 9 。 (D) 用 16S rRNA 高通量測序法評估放射第 14 天后，對照組、 TAI 和 TAI+OMT 小鼠口腔細(xì)菌屬水平的變化。 熱圖是基于行 Z 得分的顏色。 細(xì)菌水平最低和最高的小鼠分別用藍(lán)色和紅色表示。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)； 每組 n=9 。 (E-G) 放射第 14 天后，采用 16S 高通量測序法測定口腔樣本中屬水平 Bacteroides 、 Gemella 、 和 Streptococcus 的相對豐度。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)； 每組 n=9 。 (H 和 I) OMT 給藥 14 天后，測量 3 組小鼠結(jié)腸組織長度。 顯著性差異： *p ＜ 0.05 ； 兩組間雙側(cè) Student’s t 檢驗(yàn)； 每組 n=10 。 (J 和 K) 顯示經(jīng) OMT 和照射后， CRC 負(fù)荷小鼠的腫瘤。 顯著性差異： *p ＜ 0.05 ， ***p ＜ 0.001 ； 兩組間雙側(cè) Student’s t 檢驗(yàn)； 每組 n=10 。 (L 和 M) CRC 組織中 Ki-67 、 VEGF 、 CXCL1 蛋白免疫染色的代表性圖像和染色強(qiáng)度； 比例尺， 75 μm 。 顯著性差異： *p ＜ 0.05 ， ***p ＜ 0.001 ； 兩組間雙側(cè) Student’s t 檢驗(yàn)。 (N 和 O) ELISA 法檢測 3 組小鼠結(jié)腸組織中白細(xì)胞介素 -6 (IL-6) (N) 和腫瘤壞死因子 α (TNF-α) (O) 的表達(dá)水平。 顯著性差異： ***p ＜ 0.001 ； 兩組間雙側(cè) Student’s t 檢驗(yàn)，每組 n=10 。 (P 和 Q) 采用 qRT-PCR 檢測小腸組織中 IL-1 和 Glut1 水平。 顯著性差異： *p ＜ 0.05 ， **p ＜ 0.01 ， ***p ＜ 0.001 ； 兩組間雙側(cè) Student’s t 檢驗(yàn)，每組 n=10 。 倍數(shù)變化與 “Con” 組相關(guān)。 (R) HCT-8 細(xì)胞注射裸鼠肝臟腫瘤的宏觀圖。 (S) 使用 Image-Pro Plus 軟件測量 (R) 實(shí)驗(yàn)中相對腫瘤面積。 顯著性差異： *p ＜ 0.05 ， **p ＜ 0.01 ， 兩組間雙側(cè) Student’s t 檢驗(yàn) ， 每組 n =6 。 倍數(shù)變化與 “ Con ” 組相關(guān) 。 (T 和 U) CRC 肝轉(zhuǎn)移組織中 Ki-67 、 VEGF 、 Bcl-2 蛋白免疫染色的代表性圖像和染色強(qiáng)度； 比例尺， 75   μm 。 顯著性差異： *p ＜ 0.05 ， **p ＜ 0.01 ， ***p ＜ 0.001 ； 兩組間雙側(cè) Student’s t 檢驗(yàn)。 參見圖 S2 和表 S2 。

3 口腔微生物群的變化與腸道微生物群有關(guān)

接下來，我們分析了CRC位點(diǎn)和鄰近的非惡性部位(盲腸)的細(xì)菌分類學(xué)比例，以闡明口腔微生物群對放療效果不利的機(jī)制。OMT增加了TAI小鼠CRC位點(diǎn)內(nèi)細(xì)菌的α多樣性(圖S3A和S3E)，但降低了β多樣性(圖3A和3B)。PCoA進(jìn)一步顯示，OMT通過增加布勞特氏菌屬(Blautia)、Lachnospiraceae_NK4A136_group和鏈球菌(Streptococcus)在屬水平上的相對豐度，形成了CRC位點(diǎn)(圖3C和S3F)的微生物群組成(圖3D-3G)。接下來，我們評估了盲腸的細(xì)菌分類比例，發(fā)現(xiàn)OMT沒有改變CRC區(qū)域外盲腸細(xì)菌的α多樣性和β多樣性(圖3H和S3g-S3K)。PCoA圖顯示OMT小鼠盲腸細(xì)菌呈交錯分布(圖3I和S3L)，表明盲腸在屬水平上的相對豐度沒有變化(圖3J)。這一證據(jù)表明，CRC部位的微生物可能被口腔微生物群改變。

圖 3 在 TAI 后的第 14 天， OMT 改變了 CRC 負(fù)荷小鼠腫瘤部位的腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)。 “CRC” 代表 CRC 位點(diǎn)的腸道細(xì)菌譜，每組 n = 6 。 ‘‘cecum’’ 代表相鄰非惡性部位的腸道細(xì)菌譜； 每組 n=6 。 (A 和 B) β 多樣性分析用于檢測 CRC 位點(diǎn)腸道細(xì)菌組成的變化。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。 (C) 使用未加權(quán) PCoA 分析照射第 14 天 CRC 部位腸道細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)的變化。 顯著差異： AMOVA 。 (D) 應(yīng)用 16S 高通量測序技術(shù)評估照射第 14 天 TAI 和 TAI+OMT 小鼠 CRC 位點(diǎn)腸道細(xì)菌屬水平的變化。 熱圖是基于行 Z 得分的顏色。 細(xì)菌水平最低和最高的小鼠分別用藍(lán)色和紅色表示。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。 (E-G) 采用 16S 高通量測序法評估照射第 14 天 CRC 位點(diǎn) Blautia、Lachnospiraceae_NK4A136_group 和 Streptococcus 的相對豐度。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。 (H) β 多樣性分析用于測量相鄰非惡性部位腸道細(xì)菌組成譜的變化。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。 (I) 用未加權(quán) PCoA 分析在照射第 14 天相鄰非惡性部位腸道細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)的變化。 顯著性差異： AMOVA 。 (J) 采用 16S 高通量測序法評估照射第 14 天 TAI 和 TAI+OMT 小鼠相鄰非惡性部位腸道菌群屬水平的變化。 熱圖是基于行 Z 得分的顏色。 細(xì)菌水平最低和最高的小鼠分別用藍(lán)色和紅色表示。 顯著性差異： Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。 參見圖 S3 和表 S2 。

4 口腔F. nucleatum引起CRC放射抗性

口腔微生物群的改變沒有改變胃腸道的活性氧(ROS)狀態(tài)(圖S4A和S4B)，也沒有改變CRC誘導(dǎo)的結(jié)直腸致癌基因的表達(dá)水平(圖S4C和S4E)，這意味著一些口腔微生物病原體可能會對放療療效產(chǎn)生不利影響。考慮到梭桿菌屬(Fusobacterium)在結(jié)直腸中的致癌作用，我們研究了Fusobacterium是否參與了OMT衍生的CRC放射抗性。因此，我們使用16S rRNA測序分析比較了正常小鼠和AOM/DSS小鼠糞便提取物中梭桿菌的頻率。梭桿菌屬在屬水平上豐度較高(圖S4F)。此外，16S rRNA測序顯示，在OMT處理小鼠的CRC位點(diǎn)的屬水平上，F(xiàn)usobacterium進(jìn)一步富集，而在CRC周圍盲腸組織中沒有富集，表明Fusobacterium參與了AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠模型的CRC發(fā)生(圖4A和4B)。盡管沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)lemer等人報道了臨床樣本中CRC患者口腔黏膜中Fusobacterium的含量低于健康對照組。與此同時，嚴(yán)重CRC組和OMT治療組、放療抗性CRC組的動物口腔中梭桿菌的頻率相對較低(圖S5A和S5B)。因此，我們在體外培養(yǎng)了具核梭桿菌(F. nucleatum)，并將這種厭氧病原體分布到AOM/DSS誘導(dǎo)的CRC小鼠口腔中。雖然TAI降低了CRC位點(diǎn)的F. nucleatum豐度，但口腔內(nèi)F. nucleatum的補(bǔ)充也導(dǎo)致了該細(xì)菌在CRC位點(diǎn)的富集(圖4C)。雖然F. nucleatum補(bǔ)充沒有改變結(jié)腸長度(圖4D和4E)，但F. nucleatum補(bǔ)充劑可能通過促進(jìn)致瘤組織中的Ki-67、VEGF和CXCL1蛋白水平的增加(圖4H和4I)，削弱放療的殺瘤作用，并不利地增加了腫瘤的數(shù)量和體積(圖4F和4G)。ELISA分析證實(shí)，口服F. nucleatum可促進(jìn)照射后的結(jié)腸炎癥(圖4J和S5C)。最后，我們還評估了口服F. nucleatum對放射誘導(dǎo)的胃腸道毒性的影響，結(jié)果顯示，口服F. nucleatum的積累加重了腸炎(圖S5D-S5G)，惡化了上皮完整性(圖S5H-S5J)和腸道結(jié)構(gòu)(圖S5K)，表明F. nucleatum影響CRC放療的療效和預(yù)后。

通過在脾臟注射HCT-8癌細(xì)胞后進(jìn)行肝轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，我們進(jìn)一步評估了F. nucleatum在CRC肝轉(zhuǎn)移對放療抗性中的致病作用。F. nucleatum給藥顯著提高了轉(zhuǎn)移性肝組織的轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)，并提高了轉(zhuǎn)移性肝組織中蛋白水平(Ki-67、VEGF和Bcl-2)(圖4K-4N)，表明F. nucleatum處理阻礙了放療減少腫瘤轉(zhuǎn)移的療效。

圖4 口腔F. nucleatum (Fn)誘導(dǎo)CRC放射抗性。(A)采用16S rRNA測序法測定CRC位點(diǎn)Fusobacterium的相對豐度。顯著性差異：*p＜0.05；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)，每組n=8。倍數(shù)變化與“TAI”組相關(guān)。(B)采用16S rRNA測序法測定盲腸Fusobacterium的相對豐度。倍數(shù)變化與“TAI”組相關(guān)。(C) q-PCR檢測小鼠CRC位點(diǎn)F. nucleatum的豐度。顯著性差異：*p＜0.05，***p＜0.001；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)，每組n=10。倍數(shù)變化與“Con”組相關(guān)。(D和E)三組小鼠F. nucleatum給藥14天后測量結(jié)腸組織長度；每組n=10。(F和G) 顯示經(jīng)F. nucleatum處理和照射后CRC負(fù)荷小鼠腫瘤。顯著性差異：**p＜0.01，***p＜0.001；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)，每組n=10。(H和I)不同組小鼠CRC組織中具有代表性的Ki-67、VEGF和CXCL1蛋白免疫組化；比例尺，75 μm。顯著性差異：*p＜0.05，**p＜0.01；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)。(J) ELISA法檢測小鼠結(jié)腸組織中IL-6的表達(dá)水平。顯著性差異：**p＜0.01；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)，每組n=10。(K和L) F. nucleatum對照射后HCT-8細(xì)胞注射裸鼠肝臟腫瘤發(fā)生的影響。顯著性差異：*p＜0.05，***p＜0.001；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)，每組n=6。倍數(shù)變化與“Con”組相關(guān)。(M和N) CRC肝轉(zhuǎn)移性組織中Ki-67、VEGF、Bcl-2蛋白免疫染色的代表性圖像和染色強(qiáng)度；比例尺，75 μm。顯著性差異：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)。參見圖S4和S5。

5 甲硝唑改善口腔菌群改變引起的CRC放療抗性

為了克服口腔微生物介導(dǎo)的放射抗性，小鼠暴露于甲硝唑(MTZ)，一種Fusobacterium-killing抗生素，以根除胃腸道中的Fusobacterium。首先，我們將F. nucleatum菌株添加到AOM/DSS處理小鼠的口腔中。與F. nucleatum處理組相比，MTZ給藥可恢復(fù)F. nucleatum誘導(dǎo)的結(jié)腸損傷(圖5A和5B)，并顯著降低照射后的腫瘤數(shù)量和體積(圖5C和5D)以及相關(guān)蛋白水平(Ki-67、VEGF、CXCL1)(圖5E和5F)。重要的是，MTZ治療導(dǎo)致口腔和CRC部位F. nucleatum的相對豐度降低(圖5G和5H)。

其次，我們采用OMT進(jìn)一步評估MTZ對結(jié)直腸癌的放射增敏作用。正如預(yù)期的那樣，MTZ治療減輕了TAI小鼠的結(jié)腸炎(圖5I和5J)和結(jié)腸損傷(圖S6A)。重要的是，口服MTZ可以抑制由口腔微生物群失衡引起的CRC放射抗性，并顯著降低腫瘤大小(圖5K和5L)和Ki-67、VEGF和CXCL1蛋白水平(圖5M和5N)。MTZ治療還能保護(hù)口腔菌群變化導(dǎo)致加重胃腸道毒性，同時減少炎癥(圖S6B-S6E)，改善上皮細(xì)胞(圖S6F-S6H)和腸道完整性(圖S6A)。MTZ處理后第14天，兩組腸道細(xì)菌多樣性差異顯著(圖S6I-S6L)。雖然非加權(quán)和加權(quán)Unifrac分析沒有描述腸道菌群組成的顯著變化(圖5O和S6M)，但非加權(quán)和加權(quán)的PCoA圖表明，在MTZ給藥后，TAI小鼠的腸道菌群組成明顯分離，口腔菌群發(fā)生改變(圖5P和S6N)，這表明MTZ可能塑造了細(xì)菌的組成。具體來說，口服MTZ降低了口腔和CRC位點(diǎn)Fusobacterium在屬水平的相對豐度(圖5Q和5R)。熱圖分析進(jìn)一步表明，MTZ處理導(dǎo)致輻照小鼠OMT給藥后，Blautia和Odoribacter在屬水平上的相對豐度降低(圖5S)。重要的是，我們分析了其他CRC+細(xì)菌的變化，16S rRNA測序顯示，無論有無MTZ處理，CRC位點(diǎn)卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)和嗜膽菌屬(Bilophila)的相對豐度都非常低且沒有變化，表明這兩種細(xì)菌在該系統(tǒng)中沒有發(fā)揮重要作用(圖S6O和S6P)。此外，MTZ給藥后Bacteroides的頻率增加，說明細(xì)菌與MTZ誘導(dǎo)的輻射敏感性無關(guān)(圖S6Q)。綜上所述，這些結(jié)果表明口服MTZ改變了口腔菌群移植介導(dǎo)的腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)的變化。由于Fusobacterium促進(jìn)自噬，我們評估了小鼠結(jié)腸LC3I和LC3II的表達(dá)水平。如圖5T所示，OMT提高了LC3-II:I的表達(dá)比例，MTZ治療消除了LC3-II:I的表達(dá)比例，進(jìn)一步表明Fusobacterium可能參與了口腔微生物群介導(dǎo)的CRC放療抗性。

圖5 MTZ可改善OMT治療CRC的不良療效。(A、B)兩組小鼠結(jié)腸解剖照片及長度。顯著性差異：*p＜0.05；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)，每組n=10。(C和D)不同條件下CRC負(fù)荷小鼠腫瘤情況。顯著性差異：*p＜0.05；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)，每組n=10。(E和F)不同組小鼠CRC組織中Ki-67、VEGF和CXCL1蛋白免疫組化；比例尺，75 μm。顯著性差異：**p＜0.01，***p＜0.001；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)。(G和H)用q-PCR方法檢測TAI+Fn組和TAI+Fn+MTZ組口腔樣本及CRC位點(diǎn)F. nucleatum的相對豐度。顯著性差異：*p＜0.05，**p＜0.01；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)，每組n=10。倍數(shù)變化與“TAI + Fn”組有關(guān)。(I和J) 4組小鼠解剖結(jié)腸照片和定量數(shù)據(jù)。顯著性差異：*p＜0.05；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)，每組n=10。(K和L)不同條件下CRC負(fù)荷小鼠的腫瘤。顯著性差異：***p＜0.001；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)，每組n=10。(M和N)不同組小鼠結(jié)腸Ki-67、VEGF和CXCL1蛋白免疫組化；比例尺，75 μm。顯著性差異：*p＜0.05，**p＜0.01；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)。(O)采用非加權(quán)Unifrac比較腸道細(xì)菌β多樣性。顯著性差異：Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；每組n = 8�！癲ay 14”為MTZ治療小鼠14天。(P) 未加權(quán)PCoA分析MTZ處理第14天結(jié)直腸癌部位腸道細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)的變化。顯著性差異：AMOVA，每組n = 8�！癲ay 14”為MTZ治療小鼠14天。(Q和R)通過16S rRNA測序檢測口腔樣本(Q)和CRC位點(diǎn)(R)中Fusobacterium屬水平的相對豐度。顯著性差異：*p＜0.05，**p＜0.01；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)，每組n = 8�！癲ay 14”為MTZ治療小鼠14天。倍數(shù)變化與“TAI+OMT d14”組相關(guān)。(S)采用16S高通量測序法評估各組腸道菌群屬水平的變化，每組n=8。熱圖是基于行Z得分的顏色。細(xì)菌水平最低和最高的小鼠分別用藍(lán)色和紅色表示。顯著性差異：Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，每組n=8。“day 14”為MTZ治療小鼠14天。(T)采用ELISA法檢測小鼠結(jié)腸LC3II/I水平。顯著性差異：***p＜0.001；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)，每組n=12。參見圖S6和表S2。

6 口腔微生物群操縱輻射引起的腸道損傷

由于小腸是放射治療期間的主要損傷部位，我們在沒有AOM/DSS暴露的情況下研究了口腔微生物群對輻射引起的腸道損傷的影響。小鼠暴露于腹部局部照射，以模擬有或沒有OMT的放療過程。如圖6A所示，經(jīng)口腔微生物組操作的小鼠體重?fù)p失最大，顯著加重了TAI誘導(dǎo)的腸絨毛損傷(圖6B-6D)。此外，口腔微生物的改變增強(qiáng)了輻射誘導(dǎo)的腸炎(圖6E-6H)，并下調(diào)了輻照小鼠小腸中Glut1、MDR1和Pgk1的表達(dá)(圖6I-6K)，這表明口腔微生物的結(jié)構(gòu)有助于輻射介導(dǎo)的腸道和上皮損傷。我們的觀察表明，口腔菌群與輻射引起的腸道損傷有關(guān)。

圖6 OMT與照射后不良預(yù)后相關(guān)。(A) 12 Gy TAI后測量3組小鼠的體重(g)。顯著性差異：*p＜0.05，***p＜0.001；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)，每組n = 12。(B和C) 3組小鼠解剖結(jié)腸照片及定量數(shù)據(jù)。顯著性差異：*p＜0.05，***p＜0.001；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)，每組n = 12。(D) H&E染色顯示小鼠小腸形態(tài)；比例尺，75 μm。(E-H)采用qRT-PCR檢測各組小鼠小腸組織中IL-1 (E)、IL-6 (F)、TNF-α (G)、IL-10 (H)的表達(dá)水平。顯著性差異：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)，每組n = 12。倍數(shù)變化與“Con”組相關(guān)。(I-K) qRT-PCR檢測小鼠小腸組織中Glut1 (I)、MDR1 (J)和Pgk1 (K)基因的表達(dá)。顯著性差異：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；兩組間雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)，每組n = 12。倍數(shù)變化與“Con”組相關(guān)。

7 口腔-腸道菌群相互關(guān)系干擾放射誘導(dǎo)的腸道損傷

接下來，我們分析了在特制的籠子中飼養(yǎng)的小鼠的口腔細(xì)菌分類比例。TAI降低了α多樣性，導(dǎo)致未加權(quán)PCoA對口腔微生物的顯著分離(圖S7A-S7J)，表明TAI可能會輕微波動口腔細(xì)菌組成。雖然口腔菌群的α多樣性沒有顯示出顯著的變化(圖S7K-S7M)，但非加權(quán)Unifrac分析顯示OMT給藥后β多樣性顯著增加，非加權(quán)PCoA驗(yàn)證了口腔菌群的變化(圖7A和7B)，表明OMT確實(shí)改變了TAI暴露小鼠的口腔微生物群。具體來說，熱圖和MetaStat分析顯示，OMT給藥后，輻照小鼠口腔中Lachnoclostridium和阿克曼氏菌(Akkermansia)在屬水平的相對豐度下降(圖7C-7E)。

最后，我們比較了含有不同口腔菌群的輻照小鼠的腸道菌群。TAI降低了腸道細(xì)菌的豐度，而OMT消除了TAI在某些腸道細(xì)菌中引起的這種減少(圖S7N-S7P)。此外，非加權(quán)Unifrac分析表明，TAI增加了腸道細(xì)菌的β多樣性，而OMT再次減弱了β多樣性(圖7F)。非加權(quán)PCoA進(jìn)一步驗(yàn)證了TAI型腸道細(xì)菌模式通過口腔菌群改變重塑(圖7G)。有趣的是，熱圖和MetaStat分析進(jìn)一步表明，OMT處理后糞便樣本中Lachnoclostridium在屬水平上的相對豐度升高，Akkermansia在屬水平上的相對豐度降低(圖7H-7J)，表明口腔微生物可能遷移和轉(zhuǎn)移到下消化道。我們的觀察表明，口腔-腸道菌群軸有助于輻射誘導(dǎo)胃腸道損傷的預(yù)后。

圖7 OMT改變照射后腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。(A) β多樣性分析用于測量照射后0天和14天OMT小鼠口腔細(xì)菌組成的變化。顯著性差異：Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；每組n = 8。(B)采用非加權(quán)PCoA評估TAI + OMT組口腔細(xì)菌分類譜在第0天和第14天的變化。顯著性差異：AMOVA；每組n = 8。(C)采用16S高通量測序技術(shù)評估OMT照射后第0和14天小鼠口腔細(xì)菌屬水平的改變。細(xì)菌水平最低和最高的小鼠分別用藍(lán)色和紅色表示。顯著性差異：Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；每組n = 8。(D和E)用16S rRNA測序法測定口腔樣本中Lachnoclostridium和Akkermansia屬水平的相對豐度。顯著性差異：Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；每組n = 8。(F) TAI暴露14天后，采用16S rRNA高通量測序檢測小鼠腸道細(xì)菌的非加權(quán)Unifrac分析。顯著性差異：Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；每組n = 8。(G)采用16S rRNA高通量測序法檢測小鼠12 Gy TAI后第14天腸道細(xì)菌非加權(quán)PCoA。顯著性差異：AMOVA；每組n = 8。(H)在TAI暴露后的第14天，用16S rRNA高通量測序法測定小鼠腸道細(xì)菌屬水平的變化。熱圖是基于行Z得分的顏色。細(xì)菌水平最低和最高的小鼠分別用藍(lán)色和紅色表示。顯著性差異：Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；每組n = 8。(I和J)采用16S rRNA測序法測定糞便樣本中Lachnoclostridium和Akkermansia屬水平的相對豐度。顯著性差異：Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；每組n = 8。參見圖S7和表S2。  

討論

放射治療是治療局部實(shí)體腫瘤的最有效的細(xì)胞毒性治療方法，在治療過程中接受放射治療的癌癥患者將達(dá)到一半。放療是手術(shù)根除前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤的主要輔助治療方法，也是頭頸部、肺癌、膀胱癌等腫瘤的首選局部治療方法。CRC占全球每年癌癥相關(guān)發(fā)病率和死亡率的10%。放療、化療和手術(shù)切除通�？梢月�(lián)合使用，以對抗CRC和相關(guān)轉(zhuǎn)移，因?yàn)榉暖熗ǔ？梢越档褪中g(shù)切除腫瘤前的局部復(fù)發(fā)風(fēng)險。然而，放療往往與各種不良副作用相關(guān)，如胃腸道毒性，包括腹瀉、腸炎和吸收不良，不可避免地?fù)p害了癌癥患者的生活質(zhì)量。因此，重要的是制定策略來提高治療效果，同時減少放射治療的相關(guān)副作用。以往的研究表明，腸道菌群可能參與了CRC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，但其口腔對等物，口腔菌群在CRC中的作用一直被忽視。因此，我們提供令人信服的證據(jù)支持這一概念，CRC的狀態(tài)受口腔細(xì)菌群落的影響，而細(xì)菌群落的操縱可能會影響CRC組織對輻照的敏感性，這提出了口腔衛(wèi)生在與CRC和相關(guān)疾病斗爭中的重要性的重要問題。

人類消化道是共生菌群的家園。從口腔到直腸，大量的微生物寄居在宿主體內(nèi)，與宿主相互作用，維持新陳代謝、免疫和內(nèi)分泌功能的穩(wěn)態(tài)。口腔微生物群是口腔的重要組成部分，在防止可能影響全身健康的外部細(xì)菌定植方面起著重要作用。越來越多的證據(jù)表明，多種因素，如宿主免疫能力、飲食和環(huán)境影響，共同形成了互利的口腔微生物-宿主改變。我們和其他人之前的研究已經(jīng)證明腹部照射會對小鼠的腸道菌群產(chǎn)生不利影響。在本研究中我們報告了全腹照射后口腔微生物群的變化，并揭示了一種口腔微生物病原體在結(jié)直腸癌中的致病作用。我們的發(fā)現(xiàn)與以往的觀點(diǎn)一致，即口腔微生物群與多種口腔疾病有關(guān)，如齲齒、牙周病、口腔癌和低消化系統(tǒng)疾病，包括CRC、肝癌、胰腺癌和炎癥性腸病(IBD)。現(xiàn)在看來，口腔微生物群可以入侵和定殖消化道的任何部分，損害宿主的健康。通過人工操作口腔菌群，我們證明了口腔微生物組可能能夠驅(qū)動下消化道細(xì)菌分類比例的波動，在那里這些病原體損害放射治療CRC和CRC肝轉(zhuǎn)移的療效。因此，口腔衛(wèi)生培訓(xùn)和管理可能有助于在臨床環(huán)境中對抗CRC和相關(guān)疾病。

具核梭桿菌(F. nucleatum)是口腔中最常見的菌種之一，與口腔炎癥相關(guān)，包括牙周炎和牙齦炎。在與CRC相關(guān)的微生物中，F(xiàn). nucleatum因其在CRC組織中過多而備受關(guān)注。有研究表明，F(xiàn). nucleatum通過梭桿菌外膜蛋白A (FomA)、梭桿菌粘附素A (FadA)和梭桿菌自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 (Fap2)等毒力因子粘附于內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，支持在CRC中口腔F. nucleatum的致病作用。在本研究中，我們證實(shí)了在AOM/DSS小鼠的糞便顆粒中，F(xiàn)usobacterium的豐度顯著升高。此外，我們還發(fā)現(xiàn)口腔菌群改變會降低放療療效，并促進(jìn)結(jié)直腸癌部位Fusobacterium的富集，這意味著Fusobacterium可能起源于口腔菌群，并在腸道中富集。MTZ對脆弱擬桿菌(B. fragilis)、Clostridium spp.、Fusobacterium spp.和Bacteroides spp.等專性厭氧菌具有良好的活性，是治療口腔結(jié)腸炎和感染的理想選擇。放療聯(lián)合MTZ治療的CRC小鼠總腫瘤負(fù)荷和放射性腸炎均降低。重要的是，MTZ處理降低了CRC部位F. nucleatum的相對豐度。既往研究表明，F(xiàn)usobacterium部分通過刺激自噬促進(jìn)CRC放療抗性。在本研究中，我們證實(shí)口服補(bǔ)充Fusobacterium可導(dǎo)致輻照小鼠結(jié)腸中LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化的升高，而這種轉(zhuǎn)化被MTZ等抗生素的共同給藥所消除。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，口腔F. nucleatum可能會遷移并定位在CRC位點(diǎn)，從而導(dǎo)致CRC的放射抗性。我們的研究表明，口腔微生物群干擾放療治療CRC和相關(guān)肝轉(zhuǎn)移的療效。表現(xiàn)出不同嚴(yán)重程度CRC的動物有不同的口腔細(xì)菌模式�？谇晃⑸�物群移植可改變結(jié)直腸癌部位的細(xì)菌群落，但對瘤周微環(huán)境無影響�？梢�，F(xiàn). nucleatum可在結(jié)直腸癌部位遷移和定殖，從而逐漸形成對放療的抗性，但可通過聯(lián)合給藥(如MTZ)而被阻斷�？偟膩碚f，我們的發(fā)現(xiàn)為口腔微生物群在損害放療中的致病作用提供了見解，并鞏固了口腔-腸道菌群軸緊密相互作用的重要性。在臨床上，結(jié)合良好的口腔衛(wèi)生習(xí)慣和適當(dāng)?shù)目股�素使用，口腔F. nucleatum可作為一種潛在的生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)用于CRC的診斷和治療。

本研究的局限性：本研究的局限性在于輻照的技術(shù)處理，不能準(zhǔn)確定位原發(fā)性直腸癌和結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移部位。本研究的另一個局限性是缺乏臨床CRC樣本來驗(yàn)證小鼠模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。