導(dǎo)語

m6A調(diào)控因子的表達異常和基因變化與惡性腫瘤進展和免疫調(diào)節(jié)異常相關(guān)。

  背景介紹 近年來，已經(jīng)有越來越多的研究從m6A調(diào)控因子的角度出發(fā)研究癌癥的免疫相關(guān)信息，今天小編為大家?guī)�來的這篇文章通過整合結(jié)腸癌（CC）樣本的數(shù)據(jù)，評估了m6A修飾模式與TME細胞浸潤特性的相關(guān)性。文章發(fā)表在《  Theranostics  》上，影響因子為11.556，文章題目為：  m6A regulator-based methylation modification patterns characterized by distinct tumor microenvironment immune profiles in colon cancer。

 數(shù)據(jù)介紹 CC樣本的基因表達數(shù)據(jù)和臨床特征回顧性收集于NCBI GEO數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫的公開數(shù)據(jù)集。 T CGA RNA測序數(shù)據(jù)(FPKM格式)從UCSC Xena 下載，并轉(zhuǎn)換為 TPM 格式。 TCGA-COAD的基因組突變數(shù)據(jù)(包括體細胞突變和拷貝數(shù)變異)來自UCSC Xena數(shù)據(jù)庫和Davoli等人 的 研究。

  結(jié)果解析 01   結(jié)腸癌中m6A調(diào)控因子的遺傳變異概況   在本研究中，作者研究了23個m6A RNA甲基化調(diào)控基因在CC中的作用，包括writers、readers、erasers。結(jié)果如圖1A所示，這些m6A調(diào)控因子的動態(tài)可逆過程可以識別、移除和添加m6A修飾位點，并改變大量的生物學(xué)過程，如RNA剪接、RNA翻譯和RNA降解。對23個m6A調(diào)控因子進行了GO富集和meta分析，顯著富集通路如圖1B所示。 測定了 CC中23個m6A調(diào)控因子體細胞突變的發(fā)生率 ，結(jié)果如圖1C-D所示， CN V突變普遍存在 ， 23個m6A調(diào)控子在染色體上的CNV改變位置如圖1E所示 。 接下來作者基于配對的腫瘤正常樣本進行主成分分析(PCA)，發(fā)現(xiàn)23個m6A調(diào)控因子完全區(qū)分了CC樣本和正常樣本(圖1F)。進一步分析顯示相關(guān)基因在腫瘤樣本中上下調(diào)差異顯著（圖1G）。

圖 1

02   23個調(diào)控因子介導(dǎo)的m6A甲基化修飾模式的鑒定   23個m6A調(diào)控因子之間的相互作用、調(diào)控因子連接及其在CC患者中的預(yù)后意義如圖2A所示，結(jié)果表明，“writers”、“readers”和“erasers”三個調(diào)控因子之間的交互作用可能在m6A不同修飾模式的形成中起著重要作用，并與腫瘤的發(fā)病和發(fā)展有關(guān)。因此作者采用NMF算法的共識聚類分析對從GEO獲得的癌癥樣本進行分層，共確定了三個不同的修正型聚集區(qū)（圖2B），分別命名為m6A-C1（221）、m6A-C2（530）和m6A-C3（162），其中m6A-C1生存最好，m6A-C3的預(yù)后最差。 接下來作者 對TCGA-COAD隊列進行了相同的分析，得到了相似的結(jié)果( 圖 2C )。

圖 2

03   m6A修飾模式具有明顯的免疫景觀特征   為了探究三種不同m6A修飾模式下的生物分子變化，作者對Hallmarker基因集進行了GSVA富集分析(圖2D)，結(jié)果顯示，m6A-C1在免疫激活相關(guān)過程中顯著富集，m6A-C3富集通路與致癌激活和基質(zhì)通路顯著相關(guān)，m6A-C2在免疫調(diào)節(jié)和基質(zhì)相關(guān)信號通路中都高度富集。 為可視化和比較不同m6A修飾模式下28個免疫浸潤細胞亞群的相對豐富度，作者使用ssGSEA構(gòu)建了一張熱圖(圖3A)，發(fā)現(xiàn)抗腫瘤淋巴細胞亞群，如效應(yīng)記憶CD4+/CD8+ T細胞，主要富集于m6A-C1和m6A-C2亞型，而在m6A-C3亞型中，調(diào)節(jié)性T細胞等明顯升高。作者還使用CIBERSORT進一步表征了免疫浸潤剖面，使用支持向量回歸評估TME中的免疫細胞子集，在m6A甲基化修飾分層中也觀察到了一致的結(jié)果(圖3B)。

圖 3

接下來，作者使用ESTIMATE算法來量化三種修飾模式的整體免疫細胞浸潤(immune Score)和腫瘤細胞純度(tumor purity)，結(jié)果顯示，m6A-C1的免疫評分最高，其次是m6A-C2和m6A-C3(圖3C，上圖)。相反，m6A-C3的腫瘤純度高于m6A-C2和m6A-C1，說明m6A-C2和m6A-C1亞型腫瘤被更多的非腫瘤成分(如免疫細胞和基質(zhì)細胞)包圍(圖3C，下圖)。 目前有研究將CC患者分為4個主要分子亞型(CIN、CSC、dMMR和KRASm)，本研究發(fā)現(xiàn)CIN亞型主要集中在m6A-C2和m6A-C3，而dMMR亞型主要集中在m6A-C1腫瘤內(nèi)(圖3D)。已知PD-L1是預(yù)測抗PD-1/L1治療反應(yīng)的成熟生物標(biāo)志物，作者還比較了不同m6A修飾簇中PD-L1的表達水平，發(fā)現(xiàn)在m6A- c1亞型顯著上調(diào)(圖3E)。以上結(jié)果證實了這三種m6A修飾模式具有不同的免疫浸潤特征。 04   結(jié)腸癌中m6A表型相關(guān)的DEGs   為了研究3種m6A修飾表型中潛在的基因改變和表達擾動，本研究進一步研究了CC中三種m6A修飾模式中可能存在的m6A相關(guān)轉(zhuǎn)錄表達變化，應(yīng)用經(jīng)驗貝葉斯方法確定了三種m6A修飾模式之間的重疊差異表達基因(DEGs)（圖4A）。 對這些特征基因的GO富集分析顯示，與RNA修飾、轉(zhuǎn)錄和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的生物過程顯著富集(圖4B)。

圖 4

基于524個最具代表性的m6A表型相關(guān)標(biāo)記基因，作者進行了無監(jiān)督一致性聚類分析，獲得了3個穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄組表型。這些分層將患者分為三個不同的m6A基因標(biāo)記亞組，具有不同的臨床病理特征，并被定義為m6A基因- s1、m6A基因- s2和m6A基因- s3(圖4C)，作者發(fā)現(xiàn)臨床晚期患者以m6A基因-S3亞組為代表，CIN亞型和PD-L1表達下調(diào)的患者主要集中在m6A基因- s2和S3亞組。接下來作者進行了生存分析，m6A基因- s1標(biāo)記被證明與較好的預(yù)后相關(guān)，而m6A基因- s3與較差的生存結(jié)果相關(guān)(圖4D)，考慮年齡、性別、MMR和分期后，m6A基因標(biāo)記與生存率之間的相關(guān)性仍具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4E）。   05   m6Sig評分的構(gòu)建及其臨床相關(guān)性的探討   為了準(zhǔn)確預(yù)測單個腫瘤中m6A甲基化修飾的模式，作者開發(fā)了一個評分方案，稱為m6Sig評分，該評分方案基于已識別的m6A相關(guān)標(biāo)記基因，以量化單個CC患者的m6A修飾模式，使用桑基圖(圖5A)說明了m6Sig評分構(gòu)建的工作流程。作者通過Spearman分析檢驗了已知生物特征和m6Sig得分之間的關(guān)系。相關(guān)矩陣的熱圖顯示，m6Sig評分與免疫激活過程和DNA修復(fù)簽名顯著負相關(guān)，但與EMT和基質(zhì)相關(guān)簽名正相關(guān)(圖5B)。 此外，作者還確定m6Sig評分在預(yù)測生存結(jié)局方面的預(yù)后能力，結(jié)果顯示低m6Sig分數(shù)患者有更好的預(yù)后顯著相關(guān)CIT隊列(圖5C)。并且作者探索了m6Sig評分與分子亞型之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)dMMR亞型與m6Sig評分低于其他CC亞型(圖5D)。PD-L1的表達水平，在m6Sig低評分組也被發(fā)現(xiàn)有明顯的升高(圖5E)。

圖 5

結(jié)合TCGA-COAD數(shù)據(jù)庫的臨床特征和基因組信息，作者對構(gòu)建的m6A評分系統(tǒng)進行驗證。研究發(fā)現(xiàn)，m6Sig評分在TCGA隊列中具有潛在的預(yù)后預(yù)測價值，m6Sig評分低的患者具有顯著的生存獲益（圖5F)。TCGA分析顯示了CC的綜合分子特征，并建議根據(jù)MSI狀態(tài)將腫瘤細分為4個亞型。MSI-H亞型樣本的m6Sig評分顯著低于其他三種亞型樣本(圖5G)。

圖 5

越來越多的證據(jù)表明，腫瘤基因組體細胞突變和免疫治療反應(yīng)之間的聯(lián)系。因此作者研究了腫瘤突變負荷在不同m6Sig評分組中的分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)m6Sig評分低的組突變頻率更高(圖5H)。作者發(fā)現(xiàn)在m6Sig低得分亞組中，體細胞拷貝數(shù)改變(SCNA)的頻率更高，即SCNA與免疫逃避和腫瘤細胞增殖呈正相關(guān)(圖5I)。作者進一步對CC樣本中m6Sig低分組和高分組進行了顯著突變基因(SMG)分析。SMG突變圖譜顯示，PIK3CA和SMAD4在m6Sig低評分組中有較高的體細胞突變率，而TP53在m6Sig高評分亞型中有較高的體細胞突變率(圖5J)。為了進一步了解在CC中起作用的突變過程，作者從TCGA-COAD突變譜中提取了三個突變標(biāo)記（1,6,10），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，m6Sig低得分亞型具有顯著更高比例的突變特征6 (圖5J)。 06   m6Sig評分在預(yù)測免疫治療益處中的作用   免疫治療無疑是抗腫瘤治療的重大突破，作者發(fā)現(xiàn)，TIDE在m6Sig低評分組中顯著降低，而IPS在m6Sig低評分組中顯著升高(TIDE在TCGA-COAD和CIT中的分布，圖6A-B;IPS在TCGA-COAD和CIT中的分布，圖6C-D)。這些發(fā)現(xiàn)間接證明腫瘤m6A修飾模式的表達在介導(dǎo)免疫應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用。 由于m6Sig評分與免疫反應(yīng)的強相關(guān)性，作者研究了m6A修飾標(biāo)記是否可以預(yù)測三個獨立免疫治療隊列中患者對ICI治療的反應(yīng)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抗PD1隊列和抗CTLA4隊列中，m6Sig低評分組患者表現(xiàn)出顯著的臨床優(yōu)勢和顯著延長生存期( 抗PD-1, 圖6E，抗CTLA-4, 圖6G)。 與m6Sig評分高的患者相比，m6Sig評分低的患者證實了ICI治療的顯著治療效益和免疫應(yīng)答(抗PD-1，圖6F；抗CTLA-4，圖6H)。研究結(jié)果證明，m6Sig評分與免疫治療的反應(yīng)有關(guān)，可以進一步預(yù)測患者的預(yù)后。

圖 6

  小編總結(jié) 在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)了三種不同的m6A甲基化修飾模式，它們以不同的免疫表型為特征，與不同的抗癌免疫相關(guān)，還建立了一個名為“m6Sig評分”的量化系統(tǒng)來定義不同的m6A修飾模式，從而更精確地指導(dǎo)個體患者的治療策略。