編譯：微科盟藍(lán)胖兒，編輯：微科盟木木夕、江舜堯。
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導(dǎo)讀 在過(guò)去的幾年里，人們對(duì)利用天然生物活性成分的開發(fā)治療人類疾病的方法越來(lái)越感興趣。將食用菌杏鮑菇的粉末與患有C26結(jié)腸癌的小鼠的正常飲食混合。C26荷瘤小鼠存活率的顯著提高以及腫瘤中Hsp90和Hsp27蛋白水平的顯著提高。這些數(shù)據(jù)與Hsp60水平的下降相一致。飲食中引入的杏鮑菇抑制了促炎細(xì)胞因子IL-6和IL-1的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗炎作用。杏鮑菇的作用是由c-Jun NH2末端激酶的激活介導(dǎo)的，這是由飲食中引入的微量營(yíng)養(yǎng)素引起的代謝應(yīng)激的結(jié)果。在添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)的C26荷瘤小鼠的腫瘤中，有絲分裂調(diào)節(jié)因子survivin和抗凋亡因子Bcl-xL的表達(dá)減少，驅(qū)動(dòng)自噬的蛋白Atg7的表達(dá)水平增加。在本研究的假設(shè)中，這些分子的相互作用有利于添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)小鼠的存活。這些數(shù)據(jù)為杏鮑菇作為膳食補(bǔ)充劑或作為抗癌治療的佐劑的引入提供了希望。
原名：JNK pathway and heat shock response mediate the survival of C26 colon carcinoma bearing mice fed with the mushroom Pleurotus eryngii var. eryngii without affecting tumor growth or cachexia
譯名：JNK途徑和熱休克反應(yīng)介導(dǎo)以杏鮑菇為食的C26結(jié)腸癌小鼠的存活，而不影響腫瘤生長(zhǎng)或惡病質(zhì)
期刊：Food & Function
IF：4.171
發(fā)表時(shí)間：2021.2
通訊作者：Antonella Marino Gammazza
通訊作者單位：意大利巴勒莫大學(xué)生物醫(yī)學(xué)、神經(jīng)科學(xué)和高級(jí)診斷學(xué)系
首先在小鼠的飲食中添加杏鮑菇粉，由于老鼠每天的飼料攝取量約為其體重的15%，我們?cè)陲嬍持刑砑恿?.67%的杏鮑菇粉。將120.06 g杏鮑菇粉加入到1679.94 g普通飼料粉中，攪拌均勻配制成含杏鮑菇粉的綜合飼料。杏鮑菇粉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值見表1。 表1 杏鮑菇粉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值 
然后建立動(dòng)物模型，用30只C26荷瘤小鼠研究動(dòng)物模型的存活情況。在腫瘤植入前10天和直到它們死亡之前用凍干 杏鮑菇粉 和正常小鼠飲食的混合物喂養(yǎng)，每天用喂養(yǎng)4克混合物（n = 15）。用正常飲食飼養(yǎng)的小鼠作為對(duì)照組（n = 15）。此外，10只C26荷瘤小鼠（n = 5添加杏鮑菇粉和n = 5正常飲食）用于獲得用于形態(tài)學(xué)和分子檢查的樣品。在小鼠體重下降15%（惡病質(zhì)）的當(dāng)天，通過(guò)頸椎脫臼處死這些小鼠。腫瘤被切除并分成兩部分。將一半的C26腫瘤固定在含有丙酮、甲醇和水（2:2:1）的緩沖液中12小時(shí)，然后包埋在石蠟中，而其余部分在液氮中冷凍并儲(chǔ)存在80℃。福爾馬林固定的腫瘤樣品（每組5個(gè)）被包埋在石蠟中，并切成5 μm的切片。切片用蘇木精和伊紅染色進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。然后進(jìn)行了免疫熒光分析、免疫組織化學(xué)分析和蛋白印記分析。最后進(jìn)行了熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析，使用表2中給出的引物擴(kuò)增cDNA。采用2-ΔΔCT法計(jì)算轉(zhuǎn)錄水平的變化。
表2 qRT-PCR所用引物
1 添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)對(duì)C26荷瘤小鼠存活率的影響
每天用分析天平檢查小鼠的體重，通過(guò)觸診監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)（表3，腫瘤生長(zhǎng)延遲）。如表3所示，在實(shí)驗(yàn)組中，惡病質(zhì)發(fā)作有輕微但不顯著的延遲（以天為單位）。與對(duì)照組相比，添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)的小鼠存活率顯著增加（p = 0.0495，圖1）。對(duì)照組接種腫瘤后的平均存活時(shí)間為35.5天，添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)組的平均存活時(shí)間延長(zhǎng)至41.5天。
圖 1 C26荷瘤小鼠存活率。Log-rank檢驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比， 添加杏鮑菇粉 飼養(yǎng)可提高C26小鼠的存活率（p = 0.0495，n = 15/組）。
2 C26 腫瘤的宏觀和微觀評(píng)價(jià)
取10只C26荷瘤小鼠（n = 5添加杏鮑菇粉，n = 5正常飲食），在繪制存活率結(jié)果后進(jìn)行處理，用于形態(tài)學(xué)和分子檢測(cè)。這些動(dòng)物的體重、脾臟重量和腫瘤重量有輕微但不明顯的下降（表4）。宏觀上看，腫瘤呈結(jié)節(jié)狀，半透明，被包膜，易于與周圍組織分離（圖2a）。用蘇木精和伊紅染色對(duì)其進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)顯示高度細(xì)胞新生，由小的、圓形或橢圓形細(xì)胞組成，細(xì)胞質(zhì)極少，細(xì)胞核有核仁。觀察到罕見的假腺結(jié)構(gòu)（圖2b）和一些有絲分裂圖（黃色箭頭，圖2c）。
圖2 C26腫瘤的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)特征。（a）新鮮切除腫瘤的代表性圖像顯示為結(jié)節(jié)狀，半透明，有包膜，容易與周圍組織分離。（b）蘇木精和伊紅染色的代表性圖像�？梢娊䴖](méi)在間變性細(xì)胞中的假腺結(jié)構(gòu)。（c）蘇木精和伊紅染色的代表性圖像。黃色箭頭表示存在一些有絲分裂像，表明即使在 添加杏鮑菇粉飼養(yǎng) 后腫瘤仍有增殖活性。3 添加杏鮑菇粉飼養(yǎng) 對(duì)JNK及其相關(guān)分子的影響JNK蛋白及其相關(guān)分子在正常飲食飼養(yǎng)小鼠和添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)小鼠腫瘤腫塊中的表達(dá)。JNK染色在兩個(gè)組中均升高，并在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中觀察到。陽(yáng)性細(xì)胞的平均百分比在正常飲食飼養(yǎng)組為89.5%，在添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)組為87.1%，無(wú)顯著差異（圖3a和b）。p-JNK免疫組化分析顯示有核信號(hào)，陽(yáng)性細(xì)胞的平均百分比在正常飲食飼養(yǎng)組為18.2%，在 添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)組 為38.5%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)組p-JNK表達(dá)明顯高于正常飲食飼養(yǎng)組（p < 0.05）（圖3c和d）。Bcl-xL信號(hào)是細(xì)胞質(zhì)信號(hào)。Bcl-xL染色陽(yáng)性細(xì)胞的百分比在正常飲食飼養(yǎng)組為69.5%，在組為38.4%，差異顯著（p < 0.001）（圖4a和b）。此外，Survivin染色為細(xì)胞質(zhì)染色，陽(yáng)性細(xì)胞的平均百分比在正常飲食飼養(yǎng)組為29.9%，在添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)組為9.6%，差異顯著（p < 0.001)（圖4c和d）。最后，進(jìn)一步分析腫瘤中是否存在Atg7作為自噬的標(biāo)記物。如圖3e和f所示，與正常飲食飼養(yǎng)組相比添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)組Atg7表達(dá)顯著增加（陽(yáng)性細(xì)胞的平均百分比分別為9.9%和3.6%，p < 0.0001）。Atg7呈細(xì)胞質(zhì)免疫陽(yáng)性。
圖3 JNK、p-JNK和Atg7的免疫組織化學(xué)結(jié)果。（a）JNK（c）p-JNK和（e）Atg7在在 正常飲食飼養(yǎng)小鼠和添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)小鼠 腫瘤組織中的代表性圖像。黃色箭頭表示存在一些有絲分裂像，表明即使在添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)后腫瘤仍有增殖活性。（b）JNK的免疫陽(yáng)性百分比、（d）p-JNK的核陽(yáng)性百分比和（f）Atg7的細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性百分比。
圖4 Bcl-xL和survivin免疫組化結(jié)果。（a）Bcl-xL和（b）Survivin在正常飲食飼養(yǎng)小鼠和添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)小鼠腫瘤組織中的代表性圖像。（c）Bcl-xL免疫陽(yáng)性百分比和（d）Survivin細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性百分比。4 添加杏鮑菇粉飼養(yǎng) 對(duì)腫瘤中Hsp90、Hsp70、Hsp60和Hsp27蛋白水平的影響蛋白質(zhì)印跡分析和免疫熒光法用于測(cè)定Hsp90、Hsp70、Hsp60和Hsp27蛋白水平。如圖5a所示， 添加杏鮑菇粉飼養(yǎng) 顯著增加了腫瘤中的Hsp90和Hsp27蛋白水平（分別為p = 0.0350和p = 0.0400），而Hsp60蛋白水平顯著降低（p =0.0159）。相反，兩組間關(guān)于Hsp70蛋白水平的差異并不顯著。使用免疫熒光進(jìn)行的觀察證實(shí)了添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)影響Hsp90、Hsp60和Hsp27蛋白水平（圖5b）。關(guān)于這些蛋白質(zhì)的細(xì)胞位置，在各組之間沒(méi)有觀察到差異。Hsp90和Hsp27的優(yōu)先位置似乎是細(xì)胞質(zhì)，而Hsp60位于類似線粒體的小點(diǎn)上。
圖5 C26腫瘤中Hsp90、Hsp70、Hsp60和Hsp27蛋白表達(dá)水平。（a）在添加杏鮑菇飼養(yǎng)的小鼠的腫瘤中，誘導(dǎo)了Hsp90和Hsp27蛋白水平的升高和Hsp60蛋白水平的降低。β-肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)參。（b）使用免疫熒光檢測(cè)Hsp90、Hsp60和Hsp27時(shí)采集的代表性圖像。細(xì)胞核用Hoechst 33342復(fù)染。使用共聚焦顯微鏡的觀察證實(shí)了通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析獲得的數(shù)據(jù)。5 添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)對(duì)腫瘤組織中IL-6、IL-1和TNFα mRNA表達(dá)水平的影響為了更好地評(píng)價(jià)添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)對(duì)腫瘤的影響，采用qRT-PCR檢測(cè)IL-6、IL-1和TNFα的mRNA表達(dá)水平。如圖6所示，添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)導(dǎo)致IL-6和IL-1表達(dá)水平顯著下調(diào)（p = 0.0001和p = 0.0100），而TNFα表達(dá)水平?jīng)]有改變。
圖 6 C26腫瘤中IL-6、IL-1和TNFα基因表達(dá)水平。添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)小鼠C26腫瘤中IL-6和IL-1基因表達(dá)水平的下調(diào)。條形圖顯示IL-6、IL-1和TNFα基因表達(dá)水平歸一化到參照基因（GAPDH），根據(jù)Livak方法（2-ΔΔCT）。在本研究中，使用結(jié)腸癌和癌癥惡病質(zhì)的異位模型研究了添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)的效果。異位腫瘤模型（皮下腫瘤）在文獻(xiàn)中被大量使用，因?yàn)樗鼈兙哂幸子诒O(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展和評(píng)估治療干預(yù)方面具有優(yōu)勢(shì)。結(jié)果顯示，添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)的C26結(jié)腸癌小鼠比喂食正常飲食的小鼠存活時(shí)間更長(zhǎng)。此外，這些動(dòng)物的惡病質(zhì)發(fā)病沒(méi)有明顯的延遲，腫瘤重量也沒(méi)有明顯的減少。對(duì)移植腫瘤的分子和組織學(xué)分析顯示，Hsp90、Hsp60和Hsp27蛋白水平發(fā)生了顯著的改變。這些蛋白在所有組織中都有生理表達(dá)，但它們可以被應(yīng)激信號(hào)機(jī)制誘導(dǎo)，從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡、腫瘤增殖和化學(xué)抗性。在添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)的C26荷瘤小鼠的腫瘤中，觀察到Hsp90和Hsp27蛋白水平增加，同時(shí)Hsp60水平降低。Hsp90的表達(dá)增加與肺癌、食道癌、膀胱癌、黑色素瘤和白血病的預(yù)后不良有關(guān)。關(guān)于結(jié)腸癌， Hsp90的高水平反映了較低的惡性潛能。腫瘤Hsp90高水平的患者比陰性或低表達(dá)腫瘤的患者具有更好的存活率。這一發(fā)現(xiàn)可以部分解釋添加杏鮑菇分別飼養(yǎng)的C26荷瘤小鼠比用正常飲食喂養(yǎng)的小鼠存活時(shí)間長(zhǎng)。Hsp27在胃癌、前列腺癌、胰腺癌和預(yù)后不良的多種腫瘤中均有高水平的組成性表達(dá)。在本研究的模型中，Hsp27水平的增加應(yīng)該被認(rèn)為是癌細(xì)胞試圖克服可能由飲食中添加杏鮑菇分粉引起的代謝改變所引起的應(yīng)激。 添加杏鮑菇粉飼養(yǎng) 的小鼠腫瘤中Hsp60水平的降低是通過(guò)補(bǔ)充杏鮑菇中所含的微量營(yíng)養(yǎng)素對(duì)惡性腫瘤的保護(hù)作用的結(jié)果。在移植的腫瘤中觀察到的IL-6和IL-1基因表達(dá)水平的顯著降低。IL-1和IL-6是參與維持腫瘤生長(zhǎng)所需的細(xì)胞因子，特別是在腫瘤微環(huán)境中驅(qū)動(dòng)炎癥。IL-1和IL-6與促進(jìn)血管生成、癌細(xì)胞的存活、轉(zhuǎn)移和治療抗性有關(guān)。這些細(xì)胞因子是包括結(jié)腸癌在內(nèi)的不同類型癌癥發(fā)生的標(biāo)志。這些數(shù)據(jù)導(dǎo)致了一種假說(shuō)，即它們?cè)谔砑有吁U菇粉飼養(yǎng)小鼠的腫瘤中表達(dá)的下調(diào)，由杏鮑菇誘導(dǎo)的一種強(qiáng)大的抗炎作用信號(hào)，這種作用同時(shí)對(duì)抗了癌癥的侵襲性，有利于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生存。為了確定添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)觀察到的效應(yīng)中涉及的可能機(jī)制，分析了JNK轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，因?yàn)樗婕安煌纳頇C(jī)制，包括細(xì)胞存活和死亡。添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)小鼠的腫瘤顯示對(duì)p-JNK的免疫反應(yīng)性增加，對(duì)生存素和BcL-xL的免疫反應(yīng)性降低。在提出的工作假設(shè)（圖7）中，補(bǔ)充維生素、微量元素和礦物質(zhì)后，飲食中的杏鮑菇粉通過(guò)磷酸化誘導(dǎo)JNK激活。
圖7 工作假設(shè)。在飲食中添加杏鮑菇粉可誘導(dǎo)JNK途徑的激活，以響應(yīng)維生素、微量營(yíng)養(yǎng)素和礦物質(zhì)的補(bǔ)充（圖中的灰點(diǎn)）。通過(guò)磷酸化激活JNK（p-JNK）可能誘導(dǎo)HSF1激活，引發(fā)熱休克反應(yīng)。Hsp90和Hsp27水平的增加可以被認(rèn)為是癌細(xì)胞克服由代謝變化引起的壓力的一種嘗試。Hsp60蛋白水平顯著降低，Hsp60蛋白水平降低也可能與survivin的降低有關(guān)。Survivin的減少與Atg7的升高有關(guān)，Atg 7是自噬的標(biāo)志。另一方面，p-JNK最常見的活性是誘導(dǎo)c-Jun磷酸化，這可以抑制促炎細(xì)胞因子IL-6和IL-1的轉(zhuǎn)錄（Hsp60也在這種抑制中起作用）。IL-6和IL-1表達(dá)的下調(diào)可能與它們?cè)诎┌Y微環(huán)境中水平的降低平行。這種情況與營(yíng)養(yǎng)攝入可能導(dǎo)致的代謝轉(zhuǎn)換有關(guān)，可能有助于提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的癌癥生存率。C-Jun可激活抗凋亡因子Bcl-xL的降解，Bcl-Xl是凋亡和自噬之間相互作用的調(diào)節(jié)劑。Atg7的升高和survivin水平的不穩(wěn)定以及Bcl-xL的降低導(dǎo)致了自噬的恢復(fù)，這可能是飲食改變的結(jié)果，最終干擾了小鼠的存活率。本研究的結(jié)果表明，添加杏鮑菇粉飼養(yǎng)效應(yīng)可能是由 JNK 激活驅(qū)動(dòng)的多種細(xì)胞機(jī)制介導(dǎo)的。一方面， p-JNK 觸發(fā)熱休克反應(yīng)， survivin 下調(diào)，上調(diào) Atg7 。此外， p-JNK 可誘導(dǎo) IL-6 、 IL-1 、 Bcl-xL 下調(diào)，具有抗炎、促凋亡作用。 Atg7 的升高和 survivin 的不穩(wěn)定以及 Bcl-xL 水平的降低有助于自噬的恢復(fù)，這可能是飲食改變的結(jié)果，最終干擾了實(shí)驗(yàn)小鼠的存活率。這可能是首次將杏鮑菇膳食補(bǔ)充劑、 p-JNK 、應(yīng)激蛋白和炎癥細(xì)胞因子之間建立了關(guān)系。從而影響癌癥小鼠的生存。研究的分子可以作為有前途的生物標(biāo)記物，用于進(jìn)一步研究杏鮑菇作為膳食補(bǔ)充或作為抗癌治療的輔助劑。
