編譯：微科盟一山，編輯：微科盟木木夕、江舜堯。

微科盟原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載，轉(zhuǎn)載須注明來源《微生態(tài)》公眾號。

所研究人群的平均年齡為59歲(標(biāo)準(zhǔn)差為8歲)，51%的參與者是女性。抽血到診斷的中位數(shù)時間為3.4年，范圍在0到8.5年之間。患者往往比對照組更有可能肥胖(BMI≥30kg/m²)(分別為21%和16%)，以前或現(xiàn)在吸煙者(分別為59%和52%)。腸癌患者組相對于對照組有較高的每日能量攝入量(平均分別為2173 kcal和2052kcal)(表1)。

我們分別檢測了對E.coli和ETBF蛋白的IgA和IgG抗體反應(yīng)，并比較了持續(xù)熒光強(qiáng)度在病例和對照組之間的反應(yīng)水平(圖1)。這項分析是在血清陽性病例和對照中進(jìn)行的，因為一些抗原的抗體水平大多低于檢測的技術(shù)極限。病例組與對照組抗體水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。因此，在這項研究中，我們決定不更詳細(xì)地分析抗體反應(yīng)水平，而是將重點放在血清陽性上，作為一種更可靠的衡量標(biāo)準(zhǔn)。

應(yīng)用血清陽性界值(表2)將42%的對照組定義為對任何E.coli蛋白IgA陽性，相比之下，49%的病例為IgA陽性(表3)。這一差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，粗略模型中大腸癌的OR值為1.37(95%CI：1.04，1.8；p值=0.024)，多變量調(diào)整模型1的OR值為1.35(95%CI：1.02，1.79，p值=0.035)，多變量調(diào)整后的模型2調(diào)整飲食變量和體力活動后的OR值為1.42(95%CI：1.05，1.91；p值=0.022)。然而，經(jīng)FDR調(diào)整后的值沒有保持顯著性，相應(yīng)的Q值分別為0.096、0.118和0.088。鑒于p值是從一種明確的假設(shè)驅(qū)動的方法中得出的，通過對兩種細(xì)菌進(jìn)行少量的比較，我們的解釋基于觀察到的p值，并將q值作為一個保守的平衡。

對任何E.coli蛋白IgG呈陽性反應(yīng)(對照：64%，腸癌病例69%)或?qū)θ魏蜝FT亞型IgA或IgG呈陽性反應(yīng)(IgA：對照，5%，腸癌病例6%；IgG：對照，11%，腸癌病例14%)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在被評估的單個E.coli蛋白中，對照組中ClbM的抗體應(yīng)答率最低(IgA：0%和IgG：3%)，Ag43的抗體應(yīng)答率最高(IgA：16%和IgG：31%)。對于ETBF，兩種亞型的抗體應(yīng)答率相似(BFT-1：IgA，4%和IgG：6%；BFT-2：IgA：2%和IgG：9%)。E.coli Ag43蛋白IgA陽性(OR：1.55；95%CI：1.08，2.21)和ETBF毒素BFT-1IgG陽性(OR：1.80；95%CI：1.06，3.04)與大腸癌的發(fā)生有關(guān)。

我們進(jìn)一步評估了對E.coli或ETBF蛋白或其組合的IgA或IgG陽性，與結(jié)腸癌主要解剖近端或遠(yuǎn)端亞部位發(fā)生癌癥的幾率更高相關(guān)(表4)。對任何E.coli蛋白、任何ETBF蛋白均呈IgA和IgG陽性，且對這兩種蛋白均呈雙重陽性的近端結(jié)腸癌比遠(yuǎn)端結(jié)腸癌更常見(表4)。此外，E.coli蛋白或ETBF蛋白的IgG陽性反應(yīng)以及E.coli和ETBF的雙重IgG陽性反應(yīng)與發(fā)生近端結(jié)腸癌的風(fēng)險顯著相關(guān)(分別為OR：2.12；95%CI：1.20，3.76，OR：1.87；95%CI：1.04，3.34；OR：2.75；95%CI：1.16，6.50)，但與遠(yuǎn)端結(jié)腸癌的發(fā)生無統(tǒng)計學(xué)意義(OR：2.12；95%CI：1.20，3.76；OR：1.87；95%CI：1.16，6.50)。然而，異質(zhì)性的p值并不表明不同站點之間存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異(分別為0.093和0.095)。

E.coli的IgA/IgG雙重陽性與單獨檢測IgA相比，發(fā)生大腸癌的幾率更高(OR：1.57；95%CI：1.07，2.32)，而兩種細(xì)菌的聯(lián)合陽性與單個Ig類大腸癌的發(fā)生相似(盡管不顯著)。然而，這些分析的范圍有限，因為對ETBF的雙重肯定的數(shù)量很少(補(bǔ)充表S2)。

在對目前歐洲前瞻性隊列中的大腸癌病例對照研究中，我們觀察到，對涉及生物膜形成和大腸桿菌素分泌的E.coli蛋白以及對ETBF毒素的抗體陽性反應(yīng)與發(fā)生大腸癌的幾率有較高相關(guān)性。具體地說，E.coli和ETBF的IgG雙重陽性反應(yīng)提高1.79倍的大腸癌發(fā)病幾率和2.75倍的近端結(jié)腸癌癥發(fā)病幾率。雖然這些發(fā)現(xiàn)在FDR多重檢驗校正后沒有保持顯著性，但我們認(rèn)為這種校正過于嚴(yán)格，因為我們所有的分析都是根據(jù)我們的既定假設(shè)預(yù)先計劃的，相關(guān)測試的抗原數(shù)量并不多。

據(jù)我們所知，這是第一項評估E.coli和ETBF與發(fā)生大腸癌幾率之間關(guān)系的血清學(xué)研究。此前的研究主要集中在腫瘤組織或糞便樣本中直接檢測這些細(xì)菌。我們的發(fā)現(xiàn)與Dejea等人的標(biāo)志性研究一致，該研究描述了CRC患者的組織種生物膜的存在由pks+E.coli和ETBF組成。在我們的研究中，關(guān)于疾病的遺傳信息難以獲得。然而，關(guān)于散發(fā)性大腸癌患者的研究已經(jīng)證明了結(jié)腸組織中生物膜的存在，特別是在發(fā)生于近端結(jié)腸的腫瘤中�？偟膩碚f，我們研究中49%的腸癌病例對E.coli和ETBF呈IgA陽性，69%的病例對檢測中所包括的七種E.coli蛋白中的任何一種都呈IgG陽性。雖然我們無法比較本研究與前人研究中對E.coli和ETBF的血清抗體應(yīng)答率進(jìn)行比較，但有幾項研究直接在組織中檢測到了這兩種細(xì)菌。有在腫瘤組織中檢測出pks+E.coli的研究指出，在大腸癌病例中檢測出pks+E.coli的病例患病率較低，為22%至55%。然而，我們的血清學(xué)檢測包括的蛋白不一定是pks+ E.coli菌株所特有的，但通常也與宿主細(xì)胞的附著、聚集和生物膜的形成有關(guān)。這運(yùn)蛋白包括AIDA-I、Ag43、TIBA、I型菌毛FimA和FimH蛋白以及CsgA蛋白，CsgA蛋白是生物膜基質(zhì)的主要蛋白質(zhì)成分curli的一種成分。這些蛋白在不同腸癌病例中的血清抗體應(yīng)答率各不相同，F(xiàn)IMA最低(IgA1%和IgG8%)，Ag43最高(IgA 23%和IgG 33%)。這種差異也可以由同一細(xì)胞器的不同蛋白質(zhì)中引起，比如FimA和FimH作為I型菌毛的一部分，但其應(yīng)答率也不同。這可能是由于重組表達(dá)的蛋白的免疫原性不同或這些蛋白被宿主免疫系統(tǒng)識別的程度不同所致。在我們的研究中，Ag43的IgA血清陽性是唯一與發(fā)生CRC的幾率顯著相關(guān)的抗原，這可能表明這種自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在CRC發(fā)生中的重要性。有研究指出在兩個研究隊列中5%的腸癌病例中，pks+E.coli可以作為腫瘤突變的特征。這種匹配的頻率與蛋白ClbM(IgA：1%，IgG：5%)的血清抗體應(yīng)答率一致，ClbM是一種從pks+島表達(dá)的MATE家族外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與E.coli毒素蛋白colibactin的易位有關(guān)。關(guān)于大腸癌組織中ETBF與患病率關(guān)系的研究報告的指出，檢測到ETBF的病例的發(fā)病率從26%到68%不等。同樣，一項分析糞便樣本的研究發(fā)現(xiàn)，32%的大腸癌患者ETBF DNA檢測呈陽性。雖然我們納入了BFT-1和BFT-2兩種異構(gòu)體，以潛在地提高血清學(xué)檢測的靈敏度，但觀察到總體BFT應(yīng)答率較低(IgA：6%，IgG：14%)。同樣，在我們研究的大腸癌病例中，E.coli和ETBF的雙重血清陽性率(IgA：5%，IgG：12%)低于Dejea等人的報道。我們必須考慮血清學(xué)是感染發(fā)生的間接或系統(tǒng)性手段。我們試圖分別檢測粘膜和系統(tǒng)的抗體反應(yīng)，分別檢測IgA和IgG，然而這些不一定需要來自于結(jié)直腸的感染。此外，由于我們沒有血清學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)來驗證我們新開發(fā)的檢測方法，我們重組表達(dá)的蛋白可能缺乏免疫原性。這在一定程度上解釋了我們研究中獲得的細(xì)菌血清流行率與之前報道的直接檢測大腸癌患者腫瘤組織或糞便樣本中的細(xì)菌種類的不同。Messaritakis等人最近的一項研究中通過檢測健康捐獻(xiàn)者和大腸癌患者的血液中直接檢測細(xì)菌DNA來評估腸道上皮屏障的細(xì)菌移位。但作者沒有進(jìn)一步確定感染E.coli或ETBF的菌株，但在16%的健康獻(xiàn)血員和26%的病例中發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌DNA，而脆弱芽孢桿菌DNA的檢出率分別為0%和55%。將這些數(shù)據(jù)與我們的血清學(xué)分析進(jìn)行直接比較，將有助于更好地理解這項研究的結(jié)果。

在我們的研究中，IgA和IgG陽性與結(jié)直腸癌相關(guān)的OR值是相似的，盡管對于E.coli和ETBF雙重陽性檢測只對IgG的測定有統(tǒng)計學(xué)意義。這一觀察結(jié)果可能僅僅是由于IgG抗體的血清流行率較高，或者是雙重陽性的受試者的低流行率所致�？傮w而言，對所有包含的蛋白的定量IgA抗體應(yīng)答均低于相應(yīng)的IgG抗體應(yīng)答。然而，我們也不知道與腫瘤發(fā)生相關(guān)的感染時間，以及對這兩種細(xì)菌的抗體反應(yīng)時長。然而，目前尚不清楚這些微生物在癌變之前可能在多大程度上感染健康的結(jié)腸組織，或者它們是否只感染正在發(fā)育的腫瘤，這是因為細(xì)菌易位只穿過受損的腸道屏障。在這兩種情況下，細(xì)菌都可能誘導(dǎo)IgA類的粘膜抗體反應(yīng)或IgG類的系統(tǒng)抗體反應(yīng)，并可能產(chǎn)生致癌作用。由于在我們的研究中，我們既沒有能力估計血清轉(zhuǎn)換的時間點，也缺乏抽血時是否存在癌前病變的信息，所以我們的數(shù)據(jù)沒有提供這些問題的答案。文獻(xiàn)中的一個說明性例子描述了細(xì)菌駕駛員-乘客模型。在這方面，觀察到的溶血性鏈球菌與結(jié)直腸癌發(fā)生的關(guān)聯(lián)被認(rèn)為是由于腫瘤形成導(dǎo)致結(jié)腸上皮屏障受損后引起局部和全身感染的“客菌”效應(yīng)所致。E.coli和ETBF在結(jié)腸組織中的感染和生物膜形成的機(jī)制、由此產(chǎn)生的宿主免疫反應(yīng)以及這兩種細(xì)菌的潛在致癌特性可能是大腸癌發(fā)生的早期事件。然而，這一假說值得進(jìn)一步研究，以更好地理解大腸癌發(fā)病過程中致病序列的潛在含義。

我們的研究有幾個明顯的局限性和優(yōu)勢。首先，多重血清學(xué)檢測的蛋白質(zhì)選擇不是一種絕對正確的方法，而是集中在以前發(fā)表的關(guān)于潛在相關(guān)蛋白質(zhì)功能的文獻(xiàn)上。因此，在我們的研究之前，人們對這些蛋白的免疫原性知之甚少。據(jù)我們所知，目前還沒有血清學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)檢測方法可供驗證，我們使用這種新方法的結(jié)果需要在獨立研究中得到證實。與腫瘤組織化驗相比，使用血清學(xué)分析的一個主要優(yōu)點是，大多數(shù)隊列存儲了他們研究參與者的血液樣本，從而可以對與癌癥風(fēng)險的關(guān)聯(lián)進(jìn)行前瞻性分析。此外，所應(yīng)用的多重血清學(xué)允許對多個抗原以及不同Ig類的大量樣本進(jìn)行高通量分析。這使我們能夠直接比較宿主對多個細(xì)菌物種的抗體反應(yīng)，并評估了更詳細(xì)的對細(xì)菌的免疫反應(yīng)，而不僅僅是總的血清陽性率。然而，由于對眾多抗原和免疫球蛋白類別進(jìn)行了評估，人們也可能會認(rèn)為我們的研究結(jié)果需要對多重比較進(jìn)行修正。我們承認(rèn)，多重檢測的比較修正可能使我們的結(jié)果失去意義。因此，需要有更大規(guī)模的研究來證實我們的發(fā)現(xiàn)。一般來說，多重血清學(xué)的另一個優(yōu)勢是能夠量化抗體反應(yīng)的水平。由于某些抗原的免疫反應(yīng)低于技術(shù)極限，我們僅在血清陽性者中比較了定量抗體水平，沒有發(fā)現(xiàn)任何抗體水平在病例和對照之間有統(tǒng)計學(xué)差異的抗原。取而代之的是，我們將重點放在血清陽性上，將其作為大腸癌相關(guān)性的更有力的衡量標(biāo)準(zhǔn)。另一個限制是，我們沒有必要的數(shù)據(jù)來評估E.coli和ETBF血清陽性與腫瘤分子分型的關(guān)系(例如MSI或APC和KRAS突變狀態(tài))。最后，盡管對相關(guān)協(xié)變量進(jìn)行了控制，但不能完全排除殘留混雜。然而，這項研究設(shè)計的一個主要優(yōu)點是，它基于覆蓋西歐大部分地區(qū)的大型多中心隊列，包括了詳細(xì)的前瞻性數(shù)據(jù)收集和診斷前幾年采集的血清樣本。

總之，這項嵌套在EPIC內(nèi)的病例對照研究，E.coli蛋白和ETBF毒素的抗體反應(yīng)與發(fā)生大腸癌的幾率較高相關(guān)，且其主要發(fā)生在腫瘤近端。這項新開發(fā)的E.coli和ETBF多重血清學(xué)試驗的首次應(yīng)用需要在其他環(huán)境中進(jìn)行驗證，以評估這兩種細(xì)菌的存在是否會增加發(fā)生結(jié)直腸癌的風(fēng)險。