2022年5月2日，國家納米科學(xué)中心聶廣軍團(tuán)隊(duì)在 Nature Biomedical Engineering 期刊發(fā)表論文，通過對(duì)大腸桿菌進(jìn)行基因工程改造，開發(fā)了一種基因工程菌來源的基于外膜囊泡（OMV）的口服腫瘤疫苗。實(shí)現(xiàn)口服有效激活腫瘤抗原特異性免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗癌作用。

《生物世界》第一時(shí)間專訪了聶廣軍研究員，通過此次專訪，我們一起來了解基于細(xì)菌的外膜囊泡（OMV）的腫瘤疫苗的開發(fā)和應(yīng)用前景。

作為個(gè)性化腫瘤免疫療法，腫瘤疫苗通過使用由基因突變產(chǎn)生的腫瘤抗原來激活特定的細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞（CTL），然后攻擊腫瘤細(xì)胞。

目前，全世界范圍內(nèi)，已有多款腫瘤疫苗處于臨床試驗(yàn)階段，但這些臨床試驗(yàn)中的腫瘤疫苗基本都是通過肌肉注射或皮下注射進(jìn)行，其中免疫刺激僅限于有限數(shù)量的引流淋巴結(jié)。由于抗原呈遞細(xì)胞（APC）在肌肉組織和皮下的分布有限，因此需要佐劑來提高通過這些途徑施用的腫瘤疫苗的免疫原性。

實(shí)際上，腸道是人體最大的免疫器官，包含了約70%的人體免疫細(xì)胞，因此可口服的腫瘤疫苗是引發(fā)強(qiáng)烈抗腫瘤免疫反應(yīng)的有希望的替代選擇。此外，與注射相比，口服給藥通常被認(rèn)為具有更好的安全性、更好的患者依從性，以及更低的醫(yī)療費(fèi)用。

然而，由于復(fù)雜的胃腸道環(huán)境和腸上皮屏障的存在，口服腫瘤疫苗受到了很大限制。理想的口服腫瘤疫苗必須耐受胃腸道環(huán)境，才能到達(dá)腸道并克服腸上皮屏障與豐富的免疫細(xì)胞相互作用。近年來，脂質(zhì)體、聚合物納米顆粒等作為疫苗遞送載體得到了快速發(fā)展，但它們作為口服疫苗載體的有效性扔不理想，因此，迫切需要一種新的口服疫苗技術(shù)范式。

2022年5月2日，國家納米科學(xué)中心聶廣軍研究團(tuán)隊(duì)和趙瀟研究團(tuán)隊(duì)在 Nature 子刊 Nature Biomedical Engineering 發(fā)表了題為：Antigen-bearing outer membrane vesicles as tumour vaccines produced in situ by ingested genetically engineered bacteria 的研究論文【1】。

該研究通過對(duì)大腸桿菌進(jìn)行基因工程改造，建立了一種基因工程菌來源的基于外膜囊泡（OMV）的口服腫瘤疫苗，可在口服后實(shí)現(xiàn)腸道中原位可控產(chǎn)生攜帶腫瘤抗原的 OMV，OMV 能夠攜帶腫瘤抗原一起有效穿越腸上皮屏障，被固有層中的免疫細(xì)胞識(shí)別，進(jìn)而有效激活腫瘤抗原特異性免疫反應(yīng)，從而顯著抑制腫瘤生長、限制腫瘤轉(zhuǎn)移，并發(fā)揮長期保護(hù)作用。

2008年回國在國家納米科學(xué)中心建立了“納米生物學(xué)和納米生物材料”實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室主要研究方向包括腫瘤微環(huán)境調(diào)控的智能納米藥物、膜泡系統(tǒng)的納米生物效應(yīng)和藥物遞送、基于納米技術(shù)的新型治療策略等。在這些領(lǐng)域，聶廣軍團(tuán)隊(duì)發(fā)表了200多篇研究論文，并申請(qǐng)了抗腫瘤應(yīng)用等相關(guān)發(fā)明專利40余項(xiàng)。 早在2013年，聶廣軍團(tuán)隊(duì)就在 Biomaterials  期刊發(fā)表了 將外泌體作為化療藥物遞送平臺(tái)來治療癌癥 的研究論文。谷歌學(xué)術(shù)顯示被引用次數(shù)高達(dá)1159次，也是國內(nèi)最早的一批外泌體研究論文之一。 

聶廣軍 研究員告訴《生物世界》， 隨著研究的深入，越來越意識(shí)到外泌體存在一些難以突破的限制，例如產(chǎn)量低，提取難，成分復(fù)雜等等。而此時(shí)，另外一種天然來源的納米顆�！�—細(xì)菌來源的 外膜囊泡 （Outer Membrane Vesicles， OMV ），受到了自己的關(guān)注。 革蘭氏陰性細(xì)菌會(huì)分泌一類天然納米顆粒—— 外膜囊泡 （ OMV ） ，由于攜帶了豐富的病原體相關(guān)分子模式 （PAMP） ，可以激活宿主免疫系統(tǒng)。腸道細(xì)菌同樣可以分泌外膜囊泡 （OMV） ，并通過 OMV 與宿主免疫系統(tǒng)相互作用。更重要的是，腸道細(xì)菌分泌的 OMV 能夠穿過腸上皮屏障并與免疫細(xì)胞，尤其是發(fā)揮抗原呈遞作用的樹突狀細(xì)胞 （DC） 相互作用，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)能力。 

聶廣軍 研究員表示， 腫瘤疫苗通常需要通過佐劑來提高免疫原性，而 OMV 本身就可以作為天然佐劑，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤疫苗和佐劑的合而為一。腸道細(xì)菌如大腸桿菌很容易進(jìn)行基因工程改造，也容易發(fā)酵和擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，從而大量、快速獲取 OMV。此外，新西蘭、澳大利亞等地應(yīng)批準(zhǔn)了一些 OMV 作為傳染病治療藥物，這也證明了其安全性和有效性。 基于 OMV 的種種優(yōu)勢(shì)，聶廣軍團(tuán)隊(duì)和趙瀟團(tuán)隊(duì)于2021年4月在 Nature Communications 期刊發(fā)表論文 【2】 ，提出并開發(fā)了一種 基于 OMV 的通用腫瘤疫苗平臺(tái) ，將腫瘤抗原與 OMV 表面的 ClyA 蛋白融合，從而在 OMV 表面展示腫瘤抗原，用以誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。這也為后續(xù)的口服腫瘤疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

在上述研究的基礎(chǔ)上，聶廣軍團(tuán)隊(duì)對(duì)腸道中最豐富的共生菌之一的大腸桿菌，進(jìn)行基因工程改造，以開發(fā)基因工程細(xì)菌來源的口服腫瘤疫苗。 首先，將腫瘤抗原（Ag）和小鼠免疫球蛋白 G 的 Fc 片段（mFc）融合 ClyA 蛋白的 C 端，ClyA 蛋白是 OMV 表面最豐富的蛋白之一。mFc 將通過 Fc 和新生兒 Fc 受體（FcRn）之間的相互作用增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞（DC）對(duì) OMV 的識(shí)別和攝取。 聶廣軍 研究員表示， 雖然發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因工程細(xì)菌在口服24小時(shí)后被清除，但為了安全起見，還需要控制攜帶腫瘤抗原的 OMV 的產(chǎn)生，以避免長期抗原刺激引起的免疫耐受 。研究團(tuán)隊(duì)引入了阿拉伯糖（Ara）誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來控制融合蛋白的表達(dá)。只有在阿拉伯糖存在的情況下，才會(huì)誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，否則表達(dá)處于關(guān)閉狀態(tài)。 口服上述基因工程細(xì)菌和誘導(dǎo)劑阿拉伯糖后，就能實(shí)現(xiàn)在腸道中原位可控地產(chǎn)生 攜帶腫瘤抗原的外膜囊泡—— OMV-Ag-mFc 。

小鼠模型實(shí)驗(yàn)顯示，這些 OMV-Ag-mFc 能夠有效地穿過腸上皮屏障并被腸道固有層中的樹突狀細(xì)胞 （DC） 攝取， 然后產(chǎn)生引流淋巴結(jié)和腫瘤抗原呈遞。 腫瘤抗原特異性免疫激活，并在多種小鼠癌癥模型中發(fā)揮抗腫瘤作用，顯著抑制腫瘤生長 。 在肺轉(zhuǎn)移性黑色素瘤小鼠模型和皮下結(jié)腸腫瘤小鼠模型中，OMV-Ag-mFc 能夠顯著抑制腫瘤生長、減少腫瘤轉(zhuǎn)移，并發(fā)揮長期保護(hù)作用，防止腫瘤的再次復(fù)發(fā)和攻擊。 

總的來說，該研究通過對(duì)大腸桿菌進(jìn)行基因工程改造，建立了一種 基因工程菌來源的基于外膜囊泡 （OMV） 的口服腫瘤疫苗 ，可在口服后實(shí)現(xiàn)腸道中原位可控產(chǎn)生攜帶腫瘤抗原的 OMV，OMV 能夠攜帶腫瘤抗原一起有效穿越腸上皮屏障，被固有層中的免疫細(xì)胞識(shí)別，進(jìn)而有效激活腫瘤抗原特異性免疫反應(yīng)，從而顯著抑制腫瘤生長、限制腫瘤轉(zhuǎn)移，并發(fā)揮長期保護(hù)作用。 

聶廣軍 研究員告訴《生物世界》， 外膜囊泡 （OMV） 作為腫瘤疫苗載體潛力很大，除了用來展示和遞送腫瘤抗原，還可以遞送 mRNA，開發(fā) mRNA 腫瘤疫苗。 2022年3月，聶廣軍團(tuán)隊(duì)和趙瀟團(tuán)隊(duì)在 Advanced Materials 期刊發(fā)表論文 【3】 ，使用外膜囊泡（OMV）作為 mRNA 遞送平臺(tái)，通過基因工程對(duì)其進(jìn)行 RNA 結(jié)合蛋白 L7Ae 和溶酶體逃逸蛋白李斯特菌溶血素O 的表面修飾——OMV-LL。OMV-LL 可以通過 L7Ae 結(jié)合 mRNA 抗原并將它們遞送到樹突狀細(xì)胞中，然后通過李斯特菌溶血素O 介導(dǎo)的內(nèi)體逃逸進(jìn)行交叉呈遞。 

聶廣軍 研究員表示， 這項(xiàng)研究是首次探索 OMV 作為 mRNA 疫苗遞送載體，并展示了令人印象深刻的效果，OMV-LL-mRNA 能夠顯著抑制小鼠黑色素瘤進(jìn)展，導(dǎo)致37.5%的結(jié)直腸癌小鼠模型的腫瘤完全消退。OMV-LL-mRNA 可誘導(dǎo)長期免疫記憶，在60天后仍能保護(hù)小鼠免受腫瘤攻擊。 而在2021年7月， 聶廣軍 團(tuán)隊(duì)還在 Science Translational Medicine 期刊發(fā)表了一項(xiàng)引起廣泛關(guān)注的研究論文 【4】 。

該研究開創(chuàng)性地將 大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)膜 和 自體腫瘤細(xì)胞膜 整合到納米顆粒中，開發(fā)出了新型個(gè)性化癌癥疫苗，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 在手術(shù)切除腫瘤后，這些雜合膜納米顆粒誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的腫瘤特異性免疫反應(yīng)，提高了小鼠的存活率，能夠長期保護(hù)小鼠免受腫瘤的再次攻擊 。 

聶廣軍 研究員表示， 這項(xiàng)研究表明，基于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜有效激活先天免疫系統(tǒng)的個(gè)性化自體腫瘤抗原疫苗，在癌癥術(shù)后患者的個(gè)性化治療方面具有巨大潛力。目前已經(jīng)開始跟北京的幾家三甲醫(yī)院合作，開展研究者發(fā)起的臨床試驗(yàn) （IIT） ，患者將涉及非小細(xì)胞肺癌到罕見腫瘤。后續(xù)還將進(jìn)一步開發(fā)基于這種方法的通用型腫瘤疫苗。 近年來，利用基因工程微生物來遞送治療藥物或利用基因工程微生物本身作為作為治療劑，受到了越來越多的關(guān)注。聶廣軍團(tuán)隊(duì)的一系列突破性研究為基于基因工程微生物的治療應(yīng)用開辟了更為廣闊的前景。