結(jié)直腸癌中KＲAS、NＲAS 基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

文章發(fā)表于：《中國(guó)老年學(xué)雜志》

作者：潘理會(huì)、李育莊、李春輝（承德醫(yī)學(xué)院）

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【摘要】

目的：探討結(jié)直腸癌( CＲC) 中大鼠肉瘤病毒癌基因( KＲAS) 、大鼠肉瘤病毒轉(zhuǎn)化基因( NＲAS) 基因的常見(jiàn)突變類(lèi)型與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

方法：從CＲC 石蠟包埋組織中提取基因組DNA，采取實(shí)時(shí)熒光定量PCＲ 法進(jìn)行KＲAS、NＲAS 基因擴(kuò)增，分析其突變狀態(tài)與CＲC 臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

結(jié)果：檢測(cè)到86 例( 36. 1%) KＲAS 基因突變，總突變率為11例( 4. 6%) NＲAS 基因突變。不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Duke 分期的組間KＲAS 突變差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05) ，而在不同年齡、性別，腫瘤發(fā)生部位、組織學(xué)分型、分化程度、浸潤(rùn)深度的組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＞0. 05) ； NＲAS 突變?cè)诓煌�年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、組織學(xué)類(lèi)型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Duke 分期及浸潤(rùn)深度的組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＞0. 05) ； KＲAS 與NＲAS二者之間突變無(wú)相關(guān)性。

結(jié)論：CＲC 中KＲAS 突變較高，NＲAS 突變相對(duì)較低； KＲAS 突變與CＲC 的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，二者在CＲC 的進(jìn)程中可能是獨(dú)立發(fā)揮著促進(jìn)作用。

【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸癌； KＲAS 基因； NＲAS 基因； 突變；

研究報(bào)道結(jié)直腸癌( CＲC) 的發(fā)生、發(fā)展與表皮生長(zhǎng)因子受體( EGFＲ) 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路EGFＲ/大鼠肉瘤( ＲAS) /鼠類(lèi)肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體B1( BＲAF) 的調(diào)控密切相關(guān)[1]，近年一些靶向EGFＲ的單抗藥物已成功應(yīng)用于CＲC 的臨床治療，取得良好療效，但抗EGFＲ 單抗藥物的有效性受其下游ＲAS 基因[包括大鼠肉瘤病毒癌基因( KＲAS) 、大鼠肉瘤病毒轉(zhuǎn)化基因( NＲAS) ]類(lèi)型的影響，對(duì)ＲAS 野生型攜帶者療效顯著，對(duì)ＲAS 突變型患者療效不佳。目前檢測(cè)KＲAS 和NＲAS 基因突變狀態(tài)已成為眾多專(zhuān)家學(xué)者研究腫瘤靶基因治療的熱點(diǎn)課題，本文采用實(shí)時(shí)熒光定量PCＲ 檢測(cè)KＲAS、NＲAS 基因在CＲC 組織中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理參數(shù)探討二者在CＲC 發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1. 1 研究對(duì)象

選取2012 年12 月至2015 年5 月間承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的CＲC 蠟塊標(biāo)本238 例。所選標(biāo)本均有完整的臨床病歷及病理資料，且術(shù)前均未接受任何化療及抗腫瘤藥物治療。

1. 2 DNA 提取

CＲC 石蠟包埋組織連續(xù)切片4 μm厚1 ～ 2 張，蘇木精-伊紅( HE) 染色，顯鏡下觀察形態(tài)，標(biāo)記腫瘤細(xì)胞比例達(dá)70%以上的標(biāo)本。將做好標(biāo)記的標(biāo)本連續(xù)切片8 ～ 10 μm 厚5 ～ 6 張，常規(guī)脫蠟、水化處理，刮取腫瘤組織于EP 管內(nèi)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取DNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取DNA 的質(zhì)量和濃度，A260 /A280 在1. 7 ～2. 1 之間為符合標(biāo)準(zhǔn)。

1. 3 實(shí)時(shí)熒光定量PCＲ擴(kuò)增

采用PCＲTaqMan探針技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本中KＲAS、NＲAS 基因的突變情況，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。反應(yīng)體系包括模板50 ng、正反向引物各25 pmol、MasterMix 及TaqMan 標(biāo)記探針，總反應(yīng)體系各為50 μl。反應(yīng)條件分3 步: 第1 步: 42℃ 5 min，95℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)； 第2 步: 95℃ 25 s，64℃ 20 s，72℃ 20 s，15個(gè)循環(huán)； 第3 步: 93℃ 25 s，60℃ 35 s，72℃ 20 s，31個(gè)循環(huán)，第3 階段60℃收集信號(hào)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCＲ。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)定突變的陰、陽(yáng)性及空白對(duì)照孔。

1. 4 結(jié)果判讀

以無(wú)模板對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)設(shè)定閾值，沒(méi)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線或Ct≥28. 0 的標(biāo)本為陰性標(biāo)本； 出現(xiàn)擴(kuò)增曲線且Ct≤26. 0 的標(biāo)本為陽(yáng)性標(biāo)本； 26. 0 ＜Ct ＜ 28. 0 的標(biāo)本為可疑陽(yáng)性，重復(fù)檢測(cè)。

1. 5 試劑與儀器

石蠟組織DNA 提取試劑盒及人KＲAS、NＲAS 基因突變檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技有限公司； 實(shí)時(shí)熒光定量PCＲ 儀購(gòu)自杭州赫貝科技有限公司。

1. 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11. 5 軟件進(jìn)行χ2 檢驗(yàn)、Pearson 相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2. 1 KＲAS 基因突變情況及與臨床病理特征的關(guān)系

86 例( 36. 1%) KＲAS 基因突變，隨著淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和Duke 分期的增高KＲAS 突變率明顯增加( P＜0. 05) ，在其他臨床病理特征的組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＞0. 05) ，見(jiàn)表1。

2.2  NＲAS 基因突變情況及與臨床病理特征的關(guān)系

11 例( 4. 6%) NＲAS 基因突變。NＲAS 突變率在各臨床病理特征的組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＞0. 05) ，見(jiàn)表2。

2. 3 CＲC 組織中KＲAS 與NＲA 基因突變的相關(guān)性

未檢測(cè)到KＲAS 與NＲAS 同時(shí)突變者，表明二者突變相互排斥，相關(guān)分析顯示，KＲAS 與NＲAS 突變沒(méi)有明顯相關(guān)性( r = 0. 782，P = 0. 058) 。

3 討論

EGFＲ 是一種酪氨酸激酶受體，與配體結(jié)合后激活刺激其介導(dǎo)的下游信號(hào)傳導(dǎo)通路膜受體酪氨酸蛋白激酶信號(hào)傳遞途徑( ＲAS /ＲAF /MAPK) 發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖、轉(zhuǎn)移，發(fā)生癌變[1]。抗EGFＲ 單抗可通過(guò)拮抗其與配體的結(jié)合，阻止其活化，進(jìn)而阻斷其下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而發(fā)揮抗瘤作用。KＲAS 與NＲAS 基因是EGFＲ 通路下游調(diào)控因子ＲAS 家族的重要成員，二者中任何一種發(fā)生突變都可不通過(guò)EGFＲ 活化刺激而直接激活EGFＲ 通路引發(fā)癌變。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道在CＲC 中KＲAS 突變率為30%～55%，主要發(fā)生在2 外顯子12 和13 密碼子上； NＲAS 突變率為1%～ 6%，主要發(fā)生在3 外顯子61 密碼子上[2，3]。國(guó)內(nèi)研究報(bào)道CＲC 中KＲAS突變率為43. 8%，NＲAS 突變率較低為1. 9%[4]。也有報(bào)道CＲC 中KＲAS 突變率為42. 57%，NＲAS 突變率為3. 96%[5]。本研究與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的基本相符，同時(shí)本研究數(shù)據(jù)顯示KＲAS 突變率明顯高于NＲAS，KＲAS 突變?cè)贑ＲC 中是常見(jiàn)的生物學(xué)事件，可能是CＲC 發(fā)病的主要機(jī)制之一，而NＲAS 可能不是主要機(jī)制。KＲAS 的突變狀態(tài)可作為臨床選用抗EGFＲ 單抗藥物的重要參考指標(biāo)，而NＲAS 突變狀態(tài)的預(yù)測(cè)價(jià)值還在探討中。研究表明，對(duì)CＲC 患者行單一檢測(cè)KＲAS 基因是不夠的，還要聯(lián)合檢測(cè)NＲAS 基因，只有聯(lián)合檢測(cè)KＲAS、NＲAS 基因的CＲC 的患者才能建議使用EGFＲ 靶向藥物治療[6]，所以，腫瘤組織中NＲAS 突變率雖然偏低，其突變狀態(tài)的檢測(cè)是不可忽視的，聯(lián)合檢測(cè)KＲAS、NＲAS 基因突變狀況，對(duì)篩選出適應(yīng)抗EGFＲ 靶向藥物治療的患者有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

目前，關(guān)于KＲAS 和NＲAS 突變狀態(tài)與CＲC 中臨床病理參數(shù)的關(guān)系報(bào)道無(wú)統(tǒng)一定論。有文獻(xiàn)報(bào)道，CＲC 中KＲAS 突變?cè)谟辛馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期增加的患者中明顯增高[7]； CＲC 中KＲAS 突變更常見(jiàn)于女性和近端結(jié)腸[8]； CＲC 中NＲAS 突變?cè)谶h(yuǎn)端結(jié)直腸癌突變率較高[9]； 還有研究報(bào)道CＲC 患者KＲAS /NＲAS 突變與年齡相關(guān)，≥65 歲的老年患者突變率較高，而與性別、原發(fā)部位、組織學(xué)類(lèi)型、分化程度、分期、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移均無(wú)關(guān)[10， 11]。吳新新等[12]對(duì)147 例CＲC 患者的KＲAS和NＲAS 基因突變情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)KＲAS 突變的發(fā)生更傾向于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Duke 分期C 期患者，與年齡、性別、腫瘤部位、組織學(xué)類(lèi)型、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、癌結(jié)節(jié)及美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)( AJCC) 分期等均無(wú)關(guān)； NＲAS 突變與上述所有病理特征均無(wú)相關(guān)關(guān)系。代云等[13]對(duì)265 例CＲC 患者的KＲAS 和NＲAS 基因突變情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)二者突變與年齡相關(guān)，高齡患者突變率較高，而與性別、原發(fā)部位、組織學(xué)類(lèi)型、分化程度、TNM 分期、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征均無(wú)關(guān)。本研究表明KＲAS 參與了CＲC 的侵襲、轉(zhuǎn)移，預(yù)示患者預(yù)后不良； KＲAS 突變對(duì)高危轉(zhuǎn)移患者的早期篩選和預(yù)后評(píng)估有重要參考價(jià)值，也為腫瘤的侵襲、復(fù)發(fā)機(jī)制研究提供了新的方向。上述結(jié)論各家研究，差異很大，造成這些差異的原因，可能與各家研究的樣本量、檢測(cè)方法及判讀標(biāo)準(zhǔn)不同等因素有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究探討。上述研究結(jié)果表明KＲAS 和NＲAS 雖同為一個(gè)家族成員，同為EGFＲ信號(hào)通路下游重要的效應(yīng)因子，但在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所起的調(diào)控作用不盡相同。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)CＲC 中EGFＲ 信號(hào)通路上KＲAS /NＲAS 突變狀態(tài)與臨床病理參數(shù)關(guān)系的研究剛剛興起，許多認(rèn)識(shí)還不夠成熟，尤其對(duì)NＲAS 的檢測(cè)較少且檢出率偏低，提示臨床CＲC 患者抗EGFＲ 藥物治療時(shí)，應(yīng)多基因聯(lián)合檢測(cè)來(lái)指導(dǎo)靶向藥物方案的制定。明確KＲAS /NＲAS 與CＲC 病理參數(shù)的相關(guān)性，有助于闡明CＲC 發(fā)病機(jī)制，有助于CＲC 的靶基因治療。對(duì)二者突變狀態(tài)的檢測(cè)還應(yīng)擴(kuò)大檢測(cè)規(guī)模，采取多種研究手段，綜合論證分析。目前，關(guān)于腫瘤中KＲAS和NＲAS 突變之間相關(guān)性的研究國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道，有資料顯示，CＲC 中KＲAS 和NＲAS 之間基本不存在交叉突變[14]，二者突變相互排斥[15]。本研究與上述研究結(jié)果相一致，經(jīng)相關(guān)分析顯示，KＲAS 和NＲAS 之間突變沒(méi)有關(guān)聯(lián)，提示二者可能是彼此獨(dú)立的影響著CＲC 的進(jìn)程，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Ouerhani S，Bougatef K，Soltani I， et al．The prevalence and prognostic significance of KＲAS mutation in bladder cancer，chronic myeloid leukemiaand colorectal cancer[J]． Mol Biol Ｒep，2013； 40 ( 6 ) :4109-14.

[2]Ｒiely GJ，Ladanyi M. KＲAS mutations: an old oncogene becomes a new predictive biomarker[J]．J Mol Diagn，2008； 10( 6) : 493-5.

[3]Downward J. Targeting ＲAS signalling pathways in cancer therapy [J]．Nat Ｒev Cancer， 2003； 3( 1) : 11-22.

[4]孫新超，秦旭，王金海，等. 結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中KＲAS、NＲAS、BＲAF 基因突變狀態(tài)分析[J]． 社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志，2017； 15( 11) : 8-11.

[5]吳永芳，徐春偉，宋業(yè)潁，等. 結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中KＲAS、NＲAS 和BＲAF 基因突變的分子病理檢測(cè)分析[J]．臨床與病理學(xué)雜志，2015； 35( 7) : 1385-9.

[6] Dai L，Song L，Li X， et al．Association of visit-to-visit blood pressurevari ability with the risk of all-cause mortality and cardiovascular events in general population[J]． J Clin Hypertens，2018； 20 ( 2 ) :280-8.

[7]羅妙玲，徐韞健. 結(jié)直腸癌KＲAS、BＲAF 及PIK3CA 基因突變狀態(tài)分析[J]．熱帶醫(yī)學(xué)雜志， 2016； 16( 7) : 843-6.

[8]晉龍，眭玉霞，王麗萍，等. 結(jié)直腸癌KＲAS 突變與臨床病理特征的關(guān)系[J]．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2018； 38( 1) : 32-6.

[9]OguraT，Kakuta M，Yatsuka T， et al．Clinicopathological characteristics and prognostic impact of colorectal cancers with NＲAS mutations[J]．Oncol Ｒep， 2014； 32( 1) : 50-6.

[10]李艷艷，高靜，楊蕊，等. 結(jié)直腸癌ＲAS、BＲAF、KＲAS、PIK3CA基因突變分析與臨床病理特征的關(guān)系[J]． 臨床腫瘤學(xué)雜志，2016； 21( 1) : 27-33.

[11]歷金雷，蔡劍輝，任約翰，等. NＲAS、BＲAF、KＲAS、PIK3CA 基因突變檢測(cè)在結(jié)直腸癌治療和預(yù)后中的臨床價(jià)值研究[J]．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生， 2017； 55( 23) : 1-6.

[12]吳新新，馬杰，任鵬飛，等. 結(jié)直腸癌KＲAS、NＲAS 和BＲAF 基因突變與病理特征、吸煙和飲酒之間的相關(guān)性[J]．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)( 醫(yī)學(xué)版) ，2016； 51( 1) : 39-43.

[13]代云，鄭國(guó)華，李青. 結(jié)直腸癌患者BＲAF、KＲAS、NＲAS 和PIK3CA 基因突變與其病理特征的關(guān)系[J]． 臨床與病理雜志，2017； 37( 5) : 875-9.

[14]劉影，鄭細(xì)閏，朱亞珍，等. 252 例結(jié)直腸癌組織中KＲAS、NＲAS、BＲAF、PIK3CA 的基因突變分析[J]． 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2016； 32( 8) : 851-9.

[15]祁秀敏，張熔熔，唐威，等. KＲAS、NＲAS 、BＲAF 基因突變聯(lián)合檢測(cè)在轉(zhuǎn)移性大腸癌中的意義[J]． 廣東醫(yī)學(xué)，2017； 38 ( 2) :276-9．