外周血 Th17、Treg 細(xì)胞水平在潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病中的比較研究

文章發(fā)表于：《胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志》

作者：尚瑞、吳軍、盧光新、楊艷果（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院）；鄭雪皎（湖北十堰藥學(xué)部）

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【摘要】  

目的：觀察潰瘍性結(jié)腸炎( UC) 和克羅恩病( CD) 外周血單個(gè)核細(xì)胞 ( PBMCs) 中 Th17、Treg 細(xì)胞水平和 IL-17 mRNA 表達(dá)水平的差異。 探討 Th17 和Treg 在UC 和CD 發(fā)病機(jī)制中的作用。

方法：選取2014 年1 月 - 2015 年12 月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院住院治療的 IBD 患者 100 例，其中 UC 患者 50 例，CD 患者 50 例，應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)兩組患者外周血中 Th17 與 Treg細(xì)胞比例。 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)兩組患者IL-17 和Foxp3 mRNA 水平的變化。

結(jié)果：CD 患者組外周血 Th17 細(xì)胞比例為(2. 01 ± 0. 59)% ，UC 患者外周血 Th17 細(xì)胞比例(4. 55 ± 0. 75)% ，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P < 0. 05)；CD 患者組外周血reg 細(xì)胞比例為(6. 08 ± 2. 10)% ，UC 患者為(3. 27 ± 0. 97)% ，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P < 0. 05)。 UC 患者組 IL-17 mRNA 水平約是 CD 患者的 4. 5 倍；UC 患者組 Foxp3 mRNA 水平約是 CD 患者的 0. 4 倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P < 0. 05)。

結(jié)論：Th17 與Treg 細(xì)胞比例在 UC 和 CD 中有顯著性差異，可為臨床 UC 和 CD 提供新的診斷方法，從而提高 UC 和 CD 診斷的正確率。

【關(guān)鍵詞】炎癥性腸��；潰瘍性結(jié)腸炎；克羅恩�。籘h17 細(xì)胞；Treg 細(xì)胞；IL-17；

炎癥性腸病( inflammatory bowel disease， IBD)，是一種常見(jiàn)的慢性特發(fā)性腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩病( Crohn’ s disease，CD) 和潰瘍性結(jié)腸炎( ulcera- tive colitis， UC)。 近些年來(lái) IBD 的發(fā)病率呈出急速增長(zhǎng)的趨勢(shì)[1-2] 。 其確切發(fā)病機(jī)制雖然至今未知， 但是有研究數(shù)據(jù)表明，其發(fā)病的部分原因是由于易感體質(zhì)腸道菌群放松了對(duì)宿主的免疫反應(yīng)[3-4] 。 免疫反應(yīng)在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著最主要的作用，而 CD4 + CD25 + Foxp3 + 調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞( Treg ) 和輔助性 T 細(xì)胞 17 ( Th17) 是參與免疫反應(yīng)的兩種關(guān)鍵性細(xì)胞。 Treg 和Th17 是異于 Th1 和 Th2 的 CD4 + T 淋巴細(xì)胞。 Treg 細(xì)胞是 CD4 + T 細(xì)胞的一類特殊分支，主要作用是維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定性以及耐受性，并且在防止免疫炎癥反應(yīng)的增加和保護(hù)免疫機(jī)體上也發(fā)揮重要作用。近幾年，在許多動(dòng)物和人的研究中得知，丟失 Treg 細(xì)胞將會(huì)造成嚴(yán)重的自身免疫性炎癥的發(fā)生；相反，增加Treg 細(xì)胞也不利于機(jī)體健康，在許多癌癥中，增加的Treg 細(xì)胞通過(guò)與自身免疫監(jiān)控系統(tǒng)相互作用，抑制抗腫瘤免疫活性細(xì)胞的活性， 促進(jìn)腫瘤發(fā)生、 發(fā)展。Foxp3 是 Treg 細(xì)胞的特異性標(biāo)記物， 作為轉(zhuǎn)錄因子Forkhead 家族的一員，具有調(diào)控 Treg 細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的作用。 而特異性產(chǎn)生 IL-17 的 Th17 細(xì)胞則被認(rèn)為是存在于天然性免疫系統(tǒng)與獲得性免疫系統(tǒng)之間的橋梁，是炎癥反應(yīng)的使動(dòng)和調(diào)節(jié)因素[5-8] 。 Th17 細(xì)胞在固有免疫、適應(yīng)性免疫和自身免疫方面均發(fā)揮至關(guān)重要的作用。 Th17 細(xì)胞在炎癥反應(yīng)的過(guò)程中主要發(fā)揮促進(jìn)炎癥反應(yīng)的功效。

Treg 細(xì)胞和 Th17 細(xì)胞之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，在分化上二者相互協(xié)同，在功能上又相互競(jìng)爭(zhēng)， 其平衡在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵性作用。 目前，Th17 / Treg 兩種細(xì)胞的平衡紊亂已成為新的研究熱點(diǎn)，但是在CD 和 UC 中研究很少。 所以本文主要就兩種細(xì)胞在 UC 和 CD 中存在的比例差異進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 

選取 2014 年 1 月 - 2015 年 12 月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院住院治療的 IBD 患者，UC患者(活動(dòng)期)50 例，男女比例為 28∶ 22，年齡(45. 45 ± 8. 34) 歲，CD 患者( 活動(dòng)期)50 例，男女比例為 26∶ 24，年齡(48. 35 ± 7. 56) 歲。 診斷標(biāo)準(zhǔn)按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化道學(xué)分會(huì)制定的關(guān)于 IBD 診斷標(biāo)準(zhǔn)[9] 。 兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P > 0. 05)，具有可比性。兩組患者均采集肘靜脈肝素抗凝血 2. 0 ml 和 EDTA抗凝血 2. 0 ml。

1.2  納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) UC 的納入標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)性結(jié)膜、無(wú)肉芽腫、結(jié)直腸受累；(2) CD 的納入標(biāo)準(zhǔn)：從口腔至肛門(mén)慢性肉芽腫損害；呈跳躍性，延長(zhǎng)軸或腸周或分散的潰瘍的非連續(xù)性病變；活檢黏膜可見(jiàn)黏蛋白滯留。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 以各種有效的診斷方法，如細(xì)菌學(xué)、放射學(xué)、組織學(xué)排除感染性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、放射性結(jié)腸炎等；( 2 ) 懷疑有結(jié)腸癌變的患者；(3) 心、腎功能顯著下降的患者；(4) 存在其他免疫學(xué)疾病的患者。 所有入選患者均經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并且需取得每位患者的同意并簽署相應(yīng)的書(shū)面同意書(shū)。

1.3  試劑和儀器

1.3.1 試劑：布雷非得菌素 A( BFA)、4% 多聚甲醛( PFA)、細(xì)胞因子刺激劑( PMA)。 FITC-IL-17 流式抗體， APC-CD4 流式抗體， FITC-CD25 流式抗體， PE-Foxp3 流式抗體均購(gòu)自美國(guó) BD 公司。 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 試劑盒購(gòu)自中國(guó)全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3.2 儀器：流式細(xì)胞儀( 美國(guó) BD 公司)；實(shí)時(shí) PCR儀( Life Technologies)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù) 

用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組患者外周血 PBMCs 中細(xì)胞亞群 Th17 和 Treg 的比例。 用 IL-17抗體染色結(jié)果顯示為陽(yáng)性的細(xì)胞群稱作Th17 細(xì)胞，將CD4 + CD25 + Foxp3 + 三種抗體染色均顯示為陽(yáng)性的細(xì)胞群稱作 Treg 細(xì)胞。

1.4.1 Th17 細(xì)胞的檢測(cè)：用含有 100 g / L 胎牛血清( FBS) 的 1640 培養(yǎng)基，將 PBMCs 的濃度調(diào)節(jié)為 (1 ~5) × 105 個(gè)/ ml； 一支試管加入淋巴細(xì)胞刺激劑混合液 3 μl( 對(duì)照組不加淋巴細(xì)胞刺激劑混合液)；將試管放置于 37 ℃ ，且體積分?jǐn)?shù) 5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中，孵育5 h；孵育完成后以 800 r / min 離心 5 min，去上清液；用 2 ml PBS 清洗兩次，800 r / min 離心 5 min；加入固定劑 100 μl，于漩渦震蕩器上震蕩 2 ~ 5 s 混勻，然后避光， 室溫孵育 15 min，后加入 3 ml PBS 洗液，800 r / min 離心 5 min，棄上清；加入100 μl 破膜劑，避光孵育5 min，后不需清洗直接加入FITC-IL-17 流式抗體 10 μl，震蕩混勻，室溫避光孵育 30 min； Th17 細(xì)胞同型對(duì)照管則需要加 10 μl FITC-Ig G 單克隆熒光抗體；500 μl PBS 液重懸細(xì)胞，待測(cè)。

1.4.2 Treg 細(xì)胞的檢測(cè)：取流式細(xì)胞儀上樣管；每管加入 APC-CD4、FITC-CD25、PE-Foxp3 各 10 μl；每管加 APC-lg G1，F(xiàn)ITC-Ig G1、PE-Ig G1 各 10 μl( 作為對(duì)照管)，其中這三種流式抗體分別做一個(gè)單個(gè)抗體對(duì)照，以便于流式上機(jī)檢測(cè)時(shí)補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)； 加入 100 μl 抗凝全血，于漩渦震蕩儀上振蕩 2 ~ 5 s 混勻，避光室溫作用 30 min 后加入 500 μl 溶血?jiǎng)�，振蕩混勻，放�?37 ℃ 水浴箱中孵育 15 min； 待管內(nèi)液體透明后， 以 800 r / min 離心 5 min，然后將上清倒掉后加入 500 μl PBS 重懸細(xì)胞，待測(cè)。

1.5 實(shí)時(shí)定量

PCR( RT-PCR)   RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)用于檢測(cè) PBMCs 中細(xì)胞對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。 Th17 細(xì)胞檢測(cè) IL-17，而 Treg 細(xì)胞檢測(cè) Foxp3。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  

釆用 SPSS 17. 0 軟件進(jìn)行資料分析。 在開(kāi)始檢驗(yàn)前先對(duì)要處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性以及正態(tài)性檢驗(yàn)。 計(jì)量資料以 x ± s 表示，兩組之間的比較選用 t 檢驗(yàn)。 P < 0. 05 為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血 PBMCs 中 Th17 和 Treg 細(xì)胞比例

CD組患者外周血 Th17 細(xì)胞比例為(2. 01 ± 0. 59)% ，UC組患者外周血 Th17 細(xì)胞比例為(4. 55 ± 0. 75)% ，UC 組患者 Th17 細(xì)胞比例明顯高于 CD 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P < 0. 05)。

Treg 細(xì)胞：CD 組外周血 Treg 細(xì)胞比例為(6. 08 ± 2. 10)% ，UC 組為(3. 27 ± 0. 97)% ， CD 組 Treg 細(xì)胞比例明顯高于 UC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P < 0. 05)。

2.2 兩組患者 PBMCs 中 IL-17 和 Foxp3 mRNA 水平變化

UC 組 IL-17 mRNA 水平約是 CD 患者的 4. 5 倍，而 UC 組 Foxp3 mRNA 水平約是 CD 組的 0. 4 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P < 0. 05)。

3 討論

IBD 是典型的消化系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)是腹瀉、黏液膿血便、腹痛、里急后重等。 90% 以上患者都有腹瀉，輕者每日排便 3 ~ 4 次或腹瀉與便秘交替，重者每日可達(dá) 10 ~ 30 次。 且反復(fù)發(fā)作，屬慢性疾病。

IBD 是一種誘因以及致病因素迄今尚且未完全闡明的腸道炎癥性疾病。 近年來(lái)，越來(lái)越多的研究認(rèn)為， 免疫調(diào)節(jié)紊亂、基因遺傳是致病和發(fā)病機(jī)制的因素之一，但是免疫異常誘因在各種研究中占有重要地位。Th17 細(xì)胞參與了系統(tǒng)免疫紊亂發(fā)生過(guò)程，Th17 細(xì)胞和 Treg 細(xì)胞數(shù)量和( 或) 功能的相互作用( 變化及轉(zhuǎn)化) 可能是 IBD 的致病、發(fā)病的罪魁禍?zhǔn)譡10-11] 。 Th17與 Treg 細(xì)胞的失衡這一新的發(fā)現(xiàn)，給我們帶來(lái)了治療IBD 的新靶點(diǎn)，我們可以通過(guò)各種干預(yù)手段把 Th17 / Treg 細(xì)胞進(jìn)行權(quán)重配比以達(dá)到最初無(wú)炎癥時(shí)的平衡狀態(tài)，從而達(dá)到預(yù)防與治療的作用。 其實(shí)，這已成為了研究的熱點(diǎn)，也是未來(lái)發(fā)展新方向。

不過(guò)，由于體內(nèi)環(huán)境錯(cuò)綜復(fù)雜，所以在這個(gè)層面上還有很多亟待解決的問(wèn)題，如在體內(nèi)消減 Treg 細(xì)胞的安全方法、在體內(nèi)的相互影響機(jī)制及操作穩(wěn)定性等。因此，我們?nèi)孕鑼?duì) Th17 / Treg 細(xì)胞進(jìn)行更深入的研究， 從而為 IBD 預(yù)防和治療提供新的思路。

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